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专利名称 | 用于组织工程的可注射性壳聚糖水凝胶的制备方法 |
申请号 | CN200510061869.8 | 申请日期 | 2005-12-07 |
法律状态 | 权利终止 | 申报国家 | 中国 |
公开/公告日 | 2006-07-12 | 公开/公告号 | CN1799645 |
优先权 | 暂无 | 优先权号 | 暂无 |
主分类号 | A61L27/34 | IPC分类号 | A;6;1;L;2;7;/;3;4;;;A;6;1;L;2;7;/;5;2查看分类表>
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申请人 | 浙江大学 | 申请人地址 | 浙江省杭州市西湖区浙大路38号
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权利人 | 浙江大学 | 当前权利人 | 浙江大学 |
发明人 | 高长有;洪奕;沈家骢 |
代理机构 | 杭州求是专利事务所有限公司 | 代理人 | 韩介梅 |
摘要
本发明公开了一种用于组织工程的可注射性壳聚糖水凝胶的制备方法。采用碳化二亚胺缩合的方法依次将甲基丙烯酸和乳酸接枝在壳聚糖分子链中,所得的壳聚糖衍生物同时具有可聚合的不饱和碳—碳双键和水溶性。采用过硫酸铵和四甲基乙二胺氧化还原引发体系,使上述壳聚糖衍生物通过双键交联形成壳聚糖水凝胶。该壳聚糖水凝胶无毒,具生物降解性和生物相容性。本发明工艺简单,可用于组织工程中的可注射性水凝胶支架。
1.用于组织工程的可注射性壳聚糖水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
1)在常温下,将壳聚糖溶解在含甲基丙烯酸的溶液中,然后加入水溶性碳二 亚胺,于常温下进行反应,水溶性碳二亚胺与甲基丙烯酸的摩尔比为0.25~1.5, 反应结束后,置于三蒸水中透析除去未反应物质及副产物,冻干得到接枝甲基 丙烯酸的壳聚糖;
2)在常温下,将接枝甲基丙烯酸的壳聚糖溶解在含乳酸的溶液中,然后加入 水溶性碳二亚胺,于常温下进行反应,水溶性碳二亚胺与乳酸的摩尔比为0.3~ 1.8,反应结束后,置于三蒸水中透析除去未反应物质及副产物,冻干得到接枝 甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖;
3)将接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖溶解在水或磷酸盐缓冲液中,配制浓度 为1%~2.5%的接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖溶液,然后加入氧化还原引发 体系过硫酸铵和四甲基乙二胺,过硫酸铵和四甲基乙二胺的摩尔比为1∶1,引 发体系的最终浓度均为2.5mM~15mM,25℃~45℃下反应形成壳聚糖水凝胶。
技术领域\n本发明涉及一种用于组织工程的可注射性壳聚糖水凝胶的制备方法。\n背景技术\n可注射性水凝胶支架是将一种具有流动性的水凝胶预聚物与异体或自体细 胞复合后直接注射到机体缺损部位,或不与细胞复合而直接注入体内,材料到 达缺损部位后能在物理或化学刺激下原位形成具有一定机械强度、形状并且可 与体液进行交换的支架。其中不与细胞复合而直接注入体内的支架可利用注射 物周围组织的细胞扩展生长增殖形成组织。其优点主要在于细胞的体内培养环 境以及微创性。同时,水凝胶材料通常具有良好生物相容性,其水溶液环境有 利于保护细胞以及生长营养和分泌产物的运输,易用细胞粘附配体进行改性。 但水凝胶的操作比较难以控制,且机械强度一般较低。目前,采用的水凝胶材 料包括天然材料如海藻酸盐、胶原、透明质酸、琼脂、壳聚糖和明胶等以及聚 合物材料如聚反丁烯二酸丙二醇酯、聚乙二醇以及聚氧化乙烯氧化丙烯共聚物 等。凝胶在体内的凝胶方法有温敏型、化学交联型、离子交联型以及特异性交 联等。\n壳聚糖具有生物降解性和良好的生物相容性,被广泛地用于药物载体和组织 工程。由于分子间氢键强作用力,壳聚糖只在酸性条件下溶解。它可通过pH值 改变、共价键或离子键交联形成水凝胶。但是酸溶性和凝胶方法限制了壳聚糖 作为可注射水凝胶在体内组织修复中的应用。因此,对壳聚糖分子结构的改性 以促进其在中性条件下的水溶性以及建立温和的凝胶方法非常重要。目前,文 献报道了采用甘油磷酸盐(Glycero1-2-phosphate,β-GP)将壳聚糖酸性溶液调节 至中性,在37℃下形成水凝胶。在壳聚糖分子链的氨基上接枝聚异丙基丙烯酰 胺或氨基与异丁酸酐反应形成异丙基酰胺基团,所得衍生物不仅具水溶性,而 且为温敏型水凝胶。上述材料可与软骨细胞或干细胞复合,在动物体内试验中 获得积极的结果。但以上壳聚糖水凝胶由于是物理凝胶,结构不稳定,而且盐 以及不可降解的聚异丙基丙烯酰胺的存在会影响细胞的活性以及组织相容性。\n发明内容\n本发明的目的是提供一种用于组织工程的可注射性壳聚糖水凝胶的制备方 法。\n本发明的用于组织工程的可注射性壳聚糖水凝胶的制备方法,包括以下步 骤:\n1)在常温下,将壳聚糖(CS)溶解在含甲基丙烯酸(MA)的溶液中,然后 加入水溶性碳二亚胺(EDAC),于常温下进行反应,水溶性碳二亚胺与甲基丙 烯酸的摩尔比为0.25~1.5,反应结束后,置于三蒸水中透析除去未反应物质及 副产物,冻干得到接枝甲基丙烯酸的壳聚糖(CM);\n2)在常温下,将接枝甲基丙烯酸的壳聚糖溶解在含乳酸(LA)的溶液中, 然后加入水溶性碳二亚胺,于常温下进行反应,水溶性碳二亚胺与乳酸的摩尔 比为0.3~1.8,反应结束后,置于三蒸水中透析除去未反应物质及副产物,冻干 得到接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖(CML);\n3)将接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖溶解在水或磷酸盐缓冲液(PBS)中, 配制浓度为1%~2.5%的接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖溶液,然后加入氧化 还原引发体系过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TMEDA),过硫酸铵和四甲基 乙二胺的摩尔比为1∶1,引发体系的最终浓度均为2.5mM~15mM,25℃~45℃ 下反应形成壳聚糖水凝胶。\n本发明方法操作工艺简单、实施条件温和。利用在碳二亚胺存在下,氨基和 羧基以及羟基可缩合形成酰胺键以及酯键的方法制备可聚合的水溶性壳聚糖。 可以通过改变碳二亚胺与甲基丙烯酸以及乳酸的摩尔比来调控甲基丙烯酸以及 乳酸的接枝量。反应过程中的小分子物质可通过透析的方法去除。在生物相容 性的过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TMEDA)的引发作用下,壳聚糖衍生 物可通过双键交联形成壳聚糖水凝胶,其凝胶时间可通过引发剂浓度和反应温 度进行调节。特别是在常温下凝胶时间较长,而在体温下凝胶时间较短的特点 非常有利于其作为可注射性水凝胶支架的应用。本发明方法为制备可聚合的水 溶性壳聚糖以及壳聚糖水凝胶提供了一种简单可行的新方法。所得的壳聚糖衍 生物以及壳聚糖水凝胶可用于药物控释体系以及组织工程中的可注射性水凝胶 支架。\n附图说明\n图1是制备可聚合的水溶性壳聚糖的示意图及分子结构;\n图2是壳聚糖、CM和CML的红外谱图;\n图3是CML的1HNMR谱图,溶剂为D2O;\n图4是在不同EDAC与MA的摩尔比下MA接枝量的变化曲线;\n图5是在不同EDAC与LA的摩尔比下LA接枝量的变化曲线;\n图6是37℃下,1%CML在不同引发剂浓度下的凝胶时间;\n图7是不同温度下,1%CML在5mM引发剂浓度下的凝胶时间;\n图8是37℃下,不同浓度的CML溶液在5mM引发剂浓度下的凝胶时间;\n图9是37℃下,1%CML在不同引发剂浓度下制备的壳聚糖水凝胶在PBS 中的平衡溶胀比;\n图10是37℃下,1%CML在5mM引发剂下制备的壳聚糖水凝胶在PBS 和1mg/ml溶菌酶/PBS溶液中的降解;\n图11是壳聚糖衍生物的3T3细胞毒性,细胞种植密度2×104/孔;\n图12是壳聚糖水凝胶的3T3细胞毒性,细胞种植密度10×104/孔;\n图13是软骨细胞在壳聚糖水凝胶中的(a)细胞生长曲线和(b)DNA含量 随培养时间的变化,细胞种植密度400×104/ml;\n图14是采用CLSM观察不同培养时间下,软骨细胞在壳聚糖水凝胶中的生 长情况,细胞种植密度400×104/ml,采用荧光素二乙酯染活细胞(实线箭头), 溴化乙锭染死细胞(虚线箭头);其中(a)为1天,(b)为3天,(c)为6天, (d)9天,(e)为12天。\n图15是采用SEM观察软骨细胞在壳聚糖水凝胶中的形态;其中(a),(b) 均为3天,(c),(d)均为12天。\n具体实施方式\n实例l:称取壳聚糖800mg置于250ml锥形瓶中,加入100ml三蒸水和420μl MA(0.48mmol),待CS完全溶解后,加入930mg EDAC(0.48mmol),然后在 室温下,搅拌反应24h。为去除未反应的MA和其他小分子产物,将混合液置入 截止分子量为10,000Da透析袋中,在大量三蒸水和室温下透析3d,每天换2~3 次三蒸水。最后将此液体冻结,冻干,得到MA接枝的壳聚糖(CM)。CM收 率均大于90%,其结构变化见图2;MA接枝量约为23%,见图4;可在水中溶 胀。将上述400mg CM溶解在含210μl LA(0.2mmol)的50ml三蒸水中,完全 溶解后加入460mg EDAC(0.24mmol)。此混合液在室温下搅拌24h后,将混合 液置入截止分子量为10,000Da透析袋中,在大量三蒸水和室温下透析3d,每天 换2~3次三蒸水。最后将此液体冻结,冻干,得到接枝MA和LA的壳聚糖 (CML)。CML的收率均大于90%,其结构见图2和图3;LA接枝量约为52 %,见图5;在水中可完全溶解。将CML溶解在三蒸水中,配制成1%(w/v) CML溶液。将氧化剂过硫酸铵(APS)和还原剂四甲基乙二胺(TMEDA)分别配制 成1mol/l的水溶液。将5μl APS溶液和5μl TMEDA溶液按顺序加入到1%CML 溶液中,混合均匀,引发剂最终浓度为5mM。APS与TMEDA的摩尔比为1∶1。 混合液通过注射器移至模具中,在37℃下反应形成水凝胶。其凝胶时间为 5.5min,该凝胶在PBS中的平衡溶胀比约为30。见图6,图7、图8和图9。\n实例2:称取壳聚糖800mg置于250ml锥形瓶中,加入100ml三蒸水和420μl MA(0.48mmol),待CS完全溶解后,加入232.5mg EDAC(0.12mmol),然后 在室温下,搅拌反应24h。为去除未反应的MA和其他小分子产物,将混合液置 入截止分子量为10,000Da透析袋中,在大量三蒸水和室温下透析3d,每天换2~ 3次三蒸水。最后将此液体冻结,冻干,得到MA接枝的壳聚糖(CM)。CM收 率均大于90%,MA接枝量约为11.74%,见图4。\n实例3:将MA接枝量约为23%的400mg CM溶解在含210μl LA(0.2mmol) 的50ml三蒸水中,完全溶解后加入115mg EDAC(0.06mmol)。此混合液在室 温下搅拌24h后,将混合液置入截止分子量为10,000Da透析袋中,在大量三蒸 水和室温下透析3d,每天换2~3次三蒸水。最后将此液体冻结,冻干,得到产 物为MA和LA接枝壳聚糖(CML)。CML的收率均大于90%,LA接枝量约为 43.2%,见图5。\n实例4:将CML(MA接枝量23%和LA接枝量52%)溶解在水中,配制 成2.5%的CML溶液,然后加入浓度为5mM的APS和5mM的TMEDA,APS 与TMEDA的摩尔比为1∶1。37℃下放置约为8min可形成不可流动的壳聚糖水 凝胶,见图8。\n实例5:在1%CML(MA接枝量23%和LA接枝量52%)溶液中加入浓 度为5mM的APS和5mM的TMEDA,APS与TMEDA的摩尔比为1∶1。,在37℃ 下形成壳聚糖水凝胶。壳聚糖水凝胶浸泡在PBS中平衡24h后,冻干后称重 (W1)。然后将凝胶浸泡在1mg/ml溶菌酶/PBS溶液中,每隔1d或3d取样,冻 干,称重(W2)。冻干水凝胶余重比按下式计算:\n水凝胶余重比=W2/W1×100%\n壳聚糖凝胶在PBS中降解缓慢,而在溶菌酶存在下,8天降解完全,见图 10。\n实例6:称取200mg CML(MA接枝量23%和LA接枝量52%)用紫外光 照射3h灭菌后,溶解在10ml含10%小牛血清的DMEM中,并在37℃下孵育 24h,备用。用血球计数板对3T3细胞进行计数后,在96孔培养板中种植3T3 细胞,每孔2×104个细胞,培养基200μl。培养24h后,将孔中的培养基吸出, 加入200μl含CML的培养基继续培养。定期测定3T3细胞的MTT活性,计算 相对增殖率。评价CML的细胞毒性。采用含10%小牛血清的DMEM作为阴性 对照。相对增殖率计算公式如下:\n相对增殖率=OD样品/OD对照×100% 式中OD代表MTT测试液的吸光度。\nCML的3T3细胞毒性为1级毒性,符合组织工程中对材料的要求。见图11。\n实例7:采用水凝胶的析出液测定水凝胶的细胞毒性。称取一定量的CML (MA接枝量23%和LA接枝量52%)用紫外光照射3h灭菌后,先加入灭菌的 三蒸水配制成2%的CML溶液,然后加入双倍PBS配制成1%的CML/PBS溶 液。分别称取一定量的APS和TMEDA用PBS配制成1mol/l的溶液,用0.22μm 滤膜过滤灭菌。加入浓度为5mM的APS和5mM的TMEDA,APS与TMEDA 的摩尔比为1∶1,在37℃下引发制备水凝胶,然后加入含10%小牛血清的DMEM, 在37℃下孵育24h,凝胶/DMEM为100mg/ml,备用。将收集的3T3细胞计数 后,每孔种植10×104细胞,每孔加200μl新鲜DMEM,培养24h后,吸去培养 基,加入析出液,测定不同培养时间的细胞活性,计算相对增殖率。用含10% 小牛血清的DMEM作为阴性对照。壳聚糖水凝胶的细胞毒性为1级毒性,符合 组织工程中对材料的要求。见图12。\n实例8:将100mg CML(MA接枝量23%和LA接枝量52%)消毒后,配 制成1%CML/PBS溶液,备用。将收集的细胞计数后,离心,弃去上清液。加 入0.5ml PBS,吹打至细胞完全分散,形成高浓度的细胞悬液,备用。在10ml 1% CML/PBS溶液中按顺序分别加入0.22μm滤膜过滤灭菌的50μl 1M APS/PBS溶 液和50μl 1M TMEDA/PBS溶液,APS与TMEDA的摩尔比为1∶1,混合均匀。 将细胞悬液加入到该混合溶液中,混合均匀。用1ml注射器将含细胞的混合液 注射到模具中,每个模具0.25ml。完毕后,立刻将模具放入37℃的培养箱中孵 育。10min后,取出,可见溶液失去流动性,形成水凝胶。立刻将包覆细胞的水 凝胶转移到24孔培养板中,加入2ml含10%小牛血清的DMEM后,放入培养 箱。30min后,换液一次。再过90min后,弃去上清液,每孔加入2ml含20% 小牛血清的DMEM,放入培养箱培养。每两天换液一次。软骨细胞在水凝胶能 保持活性,但不增殖,后期有部分细胞死亡,见图13。细胞形态为圆形,见图 14和图15。
法律信息
- 2011-02-23
未缴年费专利权终止
IPC(主分类): A61L 27/34
专利号: ZL 200510061869.8
申请日: 2005.12.07
授权公告日: 2007.08.08
- 2007-08-08
- 2006-09-06
- 2006-07-12
引用专利(该专利引用了哪些专利)
序号 | 公开(公告)号 | 公开(公告)日 | 申请日 | 专利名称 | 申请人 | 该专利没有引用任何外部专利数据! |
被引用专利(该专利被哪些专利引用)
序号 | 公开(公告)号 | 公开(公告)日 | 申请日 | 专利名称 | 申请人 | 该专利没有被任何外部专利所引用! |