白色杆菌zjut528及在拆分甲霜灵中的应用

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白色杆菌zjut528及在拆分甲霜灵中的应用\n(一)技术领域\n[0001] 本发明涉及一株白色杆菌Albibacter sp.zjut528及在生物催化领域的应用，该菌株具有很好的、手性选择性拆分甲霜灵的能力。利用该拆分能力，建立了一条生物法生产R-甲霜灵的新工艺。\n(二)背景技术\n[0002] 随着环保观念的加强和可持续发展战略的实施，高效、低毒、高活性、低残留已成为农药发展的必然趋势。在一些手性化合物相互作用时，不同对映体往往表现出不同活性。\n有些化合物一种对映体活性是高效，另一种对映体却是低效甚至起相反的作用。甲霜灵是一种具有保护、治疗作用的白色粉末状内吸性酰胺类杀菌剂，也是一种手性农药。研究表明，甲霜灵的R-异构体的活性比S-异构体高20～30倍，而且药效持续时间更长，因此大大减少了施药次数，延长了施药周期。单一甲霜灵R-异构体较消旋体在环境中降解速度更快，减少了对环境影响。目前市售的典型精甲霜灵是由97.5％的R-体以及2.5％的S-体构成。\n[0003] 单一对映异构体可以由化学、酶法或者化学-酶法等合成。目前，大量的手性化合物的制备是通过化学拆分法完成的。生物催化优于化学合成的优点是：酶催化反应通常表现有高的立体选择性和区域选择性，而且它们能够在温和的条件下进行，因此可以避免使用较严酷的条件，从而避免引起异构化、外消旋化、差向异构化和重排问题的发生。此外，生物催化法可以减少对环境污染，节省成本，符合当今绿色化学发展趋势。\n[0004] (三)目前的R-甲霜灵(产品精甲霜灵)主要采用化学法合成。有文献报道用生物催化剂合成R-甲霜灵(Oh-Jin Park,2005,2006)，方法是用生物法拆分生产普通甲霜灵(外消旋)的中间体2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，然后利用所得R-中间体进一步合成R-甲霜灵。\n未见直接通过拆分外消旋甲霜灵生产R-甲霜灵的报道。本发明菌株细胞可以直接水解拆分外消旋甲霜灵，有很高的立体选择性和较高的催化速率。水解获得的R-甲霜灵酸可用于生产R-甲霜灵，生产工艺见图7所示。\n(四)发明内容\n[0005] 本发明目的是提供一种具有很好立体选择性的菌株——白色杆菌Albibacter sp.zjut528及其在拆分农药甲霜灵的应用。用该菌水解外消旋甲霜灵得到R-甲霜灵酸，用R-甲霜灵酸和甲醇反应合成R-甲霜灵。这是一条生物法生产R-甲霜灵的新工艺，国内外尚无报道。\n[0006] 本发明采用的技术方案是：\n[0007] 本发明提供一株新菌株——白色杆菌(Albibacter sp.)zjut528，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年10月29日，保藏编号CCTCC NO：M2015650，保藏地址：\n中国，武汉，武汉大学，邮编430072。\n[0008] 本发明还提供一种所述白色杆菌zjut528在拆分甲霜灵中的应用，具体所述的应用以白色杆菌zjut528经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋体甲霜灵为底物，以异丙醇为助溶剂，以pH7.5～8.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30～35℃、150～\n200r/min(优选30℃、180rpm)条件下进行甲霜灵的拆分反应，反应完全后，获得含(S)-甲霜灵和(R)-甲霜灵酸的反应液，将反应液分离纯化，获得(R)-甲霜灵酸。\n[0009] 进一步，所述催化剂用量以湿菌体重量计为25～40g/L反应体系，优选40g/L反应体系，所述底物甲霜灵加入量为30～50mmol/L反应体系，优选36mmol/L反应体系，所述助溶剂的加入终浓度为10～20mL/L反应体系，优选20mL/L反应体系。\n[0010] 进一步，本发明所述湿菌体的制备方法为：\n[0011] (1)将白色杆菌zjut528接种至斜面培养基，在30℃培养2～3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NH4NO3 \n1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min；\n[0012] (2)将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃培养48h，获得种子液；所述种子培养基浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NH4NO3 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min；\n[0013] (3)将种子液以体积浓度1％～10％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、180r/min的条件下培养48h，将发酵液离心，弃上清液，获得湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成：\nNaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NH4NO3 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜灵1g/L，甲醇5g/L(甲醇在培养基灭菌后，接种前加入)，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min。\n[0014] 进一步，所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，用氨水调节反应液的pH值至\n8-9，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除有机相a得到水相a，将水相a用盐酸调节pH值为\n3～5，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除水相b得到有机相b，再将有机相b在35℃～60℃旋转蒸发除去乙酸乙酯，获得R-甲霜灵酸；取R-甲霜灵酸溶于无水甲醇中(优选无水甲醇体积用量以R-甲霜灵酸质量计为8ml/g)，冰浴中滴加二氯亚砜，滴加完毕后冰浴反应\n10min，然后回流反应4h，旋蒸浓缩至无液体流出，获得浓缩液；将浓缩液溶于乙酸乙酯，用质量浓度5％Na2CO3水溶液洗涤2次，去离子水洗涤1次，去除洗涤液后加入无水硫酸镁除水，过滤后旋蒸至干，得到R-甲霜灵；所述二氯亚砜与R-甲霜灵酸物质的量之比为1.1:1。所得(R)-甲霜灵产品的ee值达到99.3％。\n[0015] 本发明所述有机相a、有机相b、水相a、水相b是指不同步骤分离得到的有机相和水相，字母本身没有含义。\n[0016] 与现有技术相比，本发明的优势主要体现在：\n[0017] 本发明首次报道了一株新菌株--白色杆菌Albibacter sp.zjut528，它能选择性拆分消旋甲霜灵，有很高的选择性和较高的拆分速率。该菌株催化36mmol/L外消旋甲霜灵的水解，30℃反应18h，底物转化率达到47.5％，eep达到99.9％，主要产物为(R)-甲霜灵酸。\n国内外尚无用生物催化剂不对称水解甲霜灵的报道。\n[0018] 此外，本发明建立了一条用白色杆菌Albibacter sp.zjut528细胞作催化剂拆分外消旋甲霜灵生产(R)-甲霜灵的新工艺，与用商品酶Lipase PS拆分(生产外消旋甲霜灵的)中间体生产(R)-甲霜灵(Oh-JinPark,2006)的工艺相比，催化剂成本低得多(催化剂是菌体细胞)、产品的ee值更高(产品的ee值达到99.3％)。\n(五)附图说明\n[0019] 图1为白色杆菌zjut528在固体培养基上培养3d的菌落形态；\n[0020] 图2为显微镜下，白色杆菌zjut528经革兰氏染色后的菌株形态；\n[0021] 图3为白色杆菌zjut528的16S rDNA系统发育分析树；\n[0022] 图4为未加菌体催化拆分外消旋体甲霜灵的正相HPLC图；\n[0023] 图5为加入菌体催化拆分外消旋体甲霜灵9h正相HPLC图；\n[0024] 图6为加入菌体催化拆分外消旋体甲霜灵18h正相HPLC图。\n[0025] 图7为用菌体细胞作催化剂，拆分外消旋甲霜灵生产R-甲霜灵的生产工艺图。\n(五)具体实施方式\n[0026] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：\n[0027] 实施例1白色杆菌Albibacter sp.zjut528菌株筛选\n[0028] 1.富集培养：\n[0029] 取5g土样置于250mL三角瓶中，加入100mL甲霜灵富集培养基(甲霜灵初始浓度为\n20mg/L)振荡培养(30℃，150rpm)1周，取5mL上层浊液于100mL新鲜的富集培养基中继续培养1周，重复上述操作过程2次，每次接种的培养物均取自于上次培养所得的培养基。取第三周所得的培养液5mL于新的甲霜灵富集培养基中，此时甲霜灵浓度提高到50mg/L，仍按上述操作连续培养2周，再按上述操作将甲霜灵浓度提高到100mg/L连续培养2周，将发酵液进行高压液相色谱(HPLC)分析，研究甲霜灵的降解情况。取最后一次所得的培养液5mL于新的甲霜灵富集培养基中，此时甲霜灵浓度提高到1g/L，连续培养2周，HPLC分析培养液中甲霜灵的降解情况。\n[0030] 甲霜灵富集培养基：K2HPO4·3H2O 2.1g/L，KH2PO4 0.4g/L，NaCl0.1g/L，MgSO4·\n7H2O 0.2g/L，CaCl2 0.025g/L，NH4NO3 0.5g/L，微量元素液10mL/L，甲霜灵(如上述不同富集阶段加入20mg/L、50mg/L、100mg/L或1g/L甲霜灵)，溶剂为水，调节pH值为7.0，121℃灭菌\n20min。\n[0031] 微量元素液终浓度组成：CoCl2 0.1g/L，MnSO4 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，CuSO4 \n0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，H3BO3 0.01g/L，Al(SO4)2·12H2O 0.01g/L，Na2MoO4·2H2O \n0.01g/L，EDTA·2Na：1g/L，配制方法：取1gEDTA·2Na溶于800mL去离子水中，再将其他组分依次加入，最后加水至1L。\n[0032] 2.初筛：\n[0033] 从富集培养基中取1mL甲霜灵降解效果较好的培养液加入到9ml无菌水中进行倍-4 -5 -6 -7\n比稀释，梯度分别为10 、10 、10 、10 涂布到甲霜灵初筛固体培养基，30℃培养3～5天后，挑取单菌落进行复筛。\n[0034] 甲霜灵初筛固体培养基：K2HPO4·3H2O 2.1g/L，KH2PO4 0.4g/L，NaCl 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2 0.025g/L，NH4NO3 0.5g/L、甲霜灵1g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，调节pH＝7.0，121℃灭菌20min。\n[0035] 3.复筛：\n[0036] 选取初筛固体平板上的单菌株，接种到复筛液体培养基，30℃，转速180r/min培养，定期取样进行HPLC分析，得到了一株转化率49.2％和eep达到了98.8％的菌株，初步记为菌株zjut528。\n[0037] 复筛液体培养基：NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，K2HPO41.0g/L，NH4NO3 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜灵1g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min。\n[0038] 实施例2菌株zjut528形态学与生理生化鉴定\n[0039] 取以实施例1获得的菌株zjut528在甲霜灵初筛固体培养基平板上30℃恒温培养箱培养3天，观察菌落形态特征，并对其进行革兰氏染色，显微镜下观察形态特征。\n[0040] 固体培养基平板上的菌落形态特征：菌株zjut528在甲霜灵初筛固体培养基平板上菌落均呈圆形，表面隆起，边缘整齐，湿润，光滑，白色，不透明，随着时间的推移，菌落未见有明显颜色变化，如图1所示。\n[0041] 革兰氏染色后的菌株形态特征：对菌株zjut528进行革兰氏染色，显微镜下观察，为革兰氏阴性菌，呈球杆状。如图2所示。\n[0042] 菌株的生理生化鉴定如表1所示，该鉴定实验在本实验室完成。曾外送用VITEK2全自动细菌鉴定仪鉴定该菌株，但无法得出鉴定结果，主要原因是它只能在极为有限的几个培养基中生长。\n[0043] 表1菌株zjut528生理生化特征\n[0044]\n[0045] 注：+表示阳性或利用，-表示阴性或不利用\n[0046] 实施例3菌株zjut528的16S rDNA分子生物学鉴定\n[0047] 以实施例1获得菌株zjut528送到上海某生物技术公司鉴定，16SrDNA的序列长度为1236bp(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)，将测序所得序列在NCBI网站上用BLAST检索Genbank中相关菌株的16SrDNA序列，并进行核苷酸同源性比对和系统发育分析，发现一株Albibacter methylovorans strain DSM22840T相似性达到了99％，菌株zjut528的系统发育树见图4所示。结合16S rDNA分子鉴定及菌株zjut528的生理生化特征，将该菌株zjut528命名为白色杆菌(Albibacter sp.)zjut528。\n[0048] 实施例4、白色杆菌zjut528湿菌体的制备\n[0049] 斜面培养：将白色杆菌zjut528接种至斜面培养基，在30℃培养2-3天，获得斜面菌体。所述斜面培养基终浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NH4NO3 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min；\n[0050] 种子培养：将斜面长好的菌体接种至种子培养基，在30℃培养48h，获得种子液。所述种子培养基浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NH4NO3 \n1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min；\n[0051] 液体发酵培养：将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、\n180r/min的条件下培养48h，将发酵液离心，弃上清液，获得湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NH4NO3 1.0g/L，酵母浸出粉\n5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜灵1g/L，甲醇5g/L(甲醇在培养基灭菌后，接种前加入)，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min。\n[0052] 实施例5、利用Albibacter sp.zjut528湿菌体催化外消旋体甲霜灵的拆分[0053] 催化反应体系总体积4mL，外消旋甲霜灵终浓度100g/L，异丙醇终浓度20mL/L，以磷酸缓冲液(pH＝8.0)为反应介质，加入实施例4制备的湿菌体0.16g。\n[0054] 催化反应条件：180rpm，30℃的条件下于摇床中反应，用HPLC进行底物和产物分析，分别反应9h、18h，反应结果见表2以及图5和图6所示。\n[0055] 表2 zjut528催化外消旋甲霜灵不对称水解结果\n[0056]\n[0057] 产物对映体过量值(ee)和底物转化率C按以下公式计算：\n[0058] 公式1：\n[0059]\n[0060] 公式2：\n[0061]\n[0062] 式中，[P]S和[P]R分别为HPLC测得样品中S和R型产物的含量，eep为产物的对映体过量值，CP为产物的摩尔浓度，CS为底物摩尔浓度，C为转化率。\n[0063] 正相HPLC分析条件：流动相：正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80：20：0.1，流速：0.8mL/min，检测紫外波长：230nm，柱温：30℃，进样量：10μl，色谱柱：250mm×4mm，大赛璐手性OD柱。用于分析底物和产物的不同对映体。\n[0064] 实施例6、从实施例5反应结束后的反应液中分离(R)-甲霜灵酸\n[0065] 实施例5反应18h后，用氨水调节反应液的pH值至8-9，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除有机相a得到水相a，将水相a用盐酸调节pH值为3～5，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除水相b得到有机相b，再将有机相b在35℃～60℃旋转蒸发除去乙酸乙酯，获得R-甲霜灵酸0.176g。\n[0066] 实施例7、用实施例6中分离所得(R)-甲霜灵酸和甲醇反应合成(R)-甲霜灵[0067] 取5g实施例6方法分离所得R-甲霜灵酸溶于40ml无水甲醇中，冰浴滴加1.5ml二氯亚砜(1.1倍于(R)-甲霜灵酸摩尔量)，滴加完毕后冰浴反应10min，然后回流反应4h，旋蒸浓缩至无液体流出，获得浓缩液。将浓缩液溶于乙酸乙酯，用质量浓度5％Na2CO3水溶液洗涤2次，去离子水洗涤1次。去除洗涤液后加入无水硫酸镁除水，过滤后旋蒸至干，得到R-甲霜灵\n4.24g，总产率为84.6％，ee值为99.3％。