基于上转换纳米材料与BHQ-1共振能量转移的上转换荧光探针

1.一种基于上转换纳米材料与BHQ‑1共振能量转移的上转换荧光探针，以水溶性上转换荧光纳米材料为能量供体，以猝灭剂BHQ‑1为能量受体，所述上转换荧光探针由以下方法制备得到：
S1、制备水溶性上转换荧光纳米材料；
所述水溶性上转换荧光纳米材料由如下方法制备得到：
1)以稀土氯化物为原料，油酸为配体，1‑十八烯为高温有机溶剂，采用高温溶剂热法合成油酸包裹的稀土上转换纳米粒子：
将稀土氯化物用浓盐酸溶解后加入三口烧瓶中，向其中加入NaF，再向其中加入油酸和
1‑十八烯，在氩气保护下，加热搅拌，除去混合液中的水和氧，然后在280‑300℃下保持2‑4 h；再将混合液在200‑300℃下退火1‑3h；冷却至室温后，离心、洗涤得到油酸包裹的稀土上转换纳米粒子，将上转换纳米粒子重新分散在环己烷中备用，用时从环己烷中离心分离；
2)采用在酸性环境下超声辅助乙醇法将稀土上转换纳米粒子表面包裹的油酸配体去除：
将无水乙醇和浓盐酸加入到步骤1）得到的油酸包裹的稀土上转换纳米粒子中，超声，然后离心，洗涤，得到裸露的上转换纳米颗粒；
3)采用表面配体交换法，使用聚丙烯酸对稀土上转换荧光纳米粒子进行水溶性修饰：
将步骤2)制得的裸露的上转换纳米颗粒加入到含聚丙烯酸的超纯水中，将混合液于室温下搅拌10‑20h，然后离心，洗涤，即制得聚丙烯酸包裹的上转换荧光纳米颗粒；
S2、采用酰胺化反应，在水溶性上转换荧光纳米材料表面偶联5′端修饰有氨基、3′端修饰有BHQ‑1的癌抗原HE4适配体，得到上转换荧光探针；
所述癌抗原HE4适配体的碱基序列从5′到3′为：
CACCATTATCGTACGACAGTCATCCTACACAATGGT，其5′端修饰有氨基，3′端修饰有BHQ‑1。
2.根据权利要求1所述的上转换荧光探针，其特征在于，所述S2具体操作为：
将S1的水溶性上转换荧光纳米材料分散到MES缓冲溶液中；然后将1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶液和N‑羟基硫代琥珀酰亚胺Sulfo‑NHS溶液加入到上述分散液中，接着将混合液在30‑45℃下孵育0.5‑2h，离心，并将获得的沉淀物分散在含癌抗原HE4适配体的HEPES缓冲溶液中；然后将混合物在30‑45℃下孵育10‑15 h，再将Tris‑HCl添加到混合物中以封闭多余的Sulfo‑NHS，离心，并用水洗涤，得到上转换荧光探针；
所述水溶性上转换荧光纳米材料与癌抗原HE4适配体的用量比为1mg ：0.1‑2nmol。
3.根据权利要求1所述的上转换荧光探针，其特征在于，所述水溶性上转换荧光纳米材料与1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液中EDC·HCl、N‑羟基硫代琥珀酰亚胺溶液中Sulfo‑NHS的质量比为1：0.5：1。
4.根据权利要求1所述的上转换荧光探针，其特征在于，在步骤1)中，所述稀土氯化物为氯化钇、氯化镱和X元素氯化物的混合物，其中Y、Yb与X元素的摩尔比为（70～90）：（5～
30）：（0.1～1），其中X是Er或Tm。
5.根据权利要求1所述的上转换荧光探针，其特征在于，所述步骤1)中稀土氯化物、NaF、油酸和1‑十八烯的用量比为1mmol：（10‑30）mmol：（2‑10）mL：（2‑20）mL。
6.根据权利要求1所述的上转换荧光探针，其特征在于，在步骤3)中，裸露的上转换纳米颗粒与聚丙烯酸的用量比为1mg：（3 6）nmol。
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基于上转换纳米材料与BHQ‑1共振能量转移的上转换荧光\n探针\n技术领域\n[0001] 本发明涉及纳米材料和分析化学技术领域，尤其涉及一种基于上转换纳米材料与BHQ‑1猝灭基团荧光共振能量转移检测HE4的方法。\n背景技术\n[0002] 卵巢恶性肿瘤是目前国内外最常见的妇科癌症之一，其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，发病率为1.4％。随着科技，社会及医疗设施的不断发展，科学家们在肿瘤治疗如新药研发、医疗设施改进以及治疗方案的优化等方面做了相当大的努力，但其死亡率仍高居妇科恶性肿瘤首位，其五年内生存率仅为3～19％。其中，造成其死亡率居高不下的重要原因之一是缺乏准确进行早期癌症诊断的分析方法。据统计，70％的病人在初诊时已发展为晚期患者，这也极大的加剧了病人的死亡率。即便已经开发了许多用于早期诊断各种卵巢肿瘤标记物的分析方法，但因为卵巢癌症患者的早期病症并不明显，外加各种物理影像学检测费用高昂且费时，所以，对于许多早期无症状、又无家族疾病史的妇女进行早期卵巢恶性肿瘤的诊断收效甚微。因此，对病患进行卵巢恶性肿瘤的早期诊断对于改善卵巢恶性肿瘤患者的预后具有极其重要的意义。\n[0003] 人附睾蛋白4(HE4)是一种新型的卵巢肿瘤的特异性标志物，它的过量表达可促进卵巢癌细胞的增殖，浸润以及转移。与CA125相比，其在疾病早期阶段就有较高的特异性和灵敏度，因此HE4的检测在卵巢癌早期诊断中具有巨大的潜力。同时，HE4水平的变化与病程的发展有着密切的关系，所以 HE4在疗效评估和复发检测方面也有重要价值。\n[0004] 目前，对HE4肿瘤标志物进行早期检测的分析方法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)，近红外光致发光法，电化学分析法，微流控芯片电泳法，荧光免疫法等等。然而，由于上述检测方法存在着检测灵敏度低、时间长、实验步骤繁琐、底物不稳定、成本高和样品量大等缺陷而极大限制了其应用和发展。因此，急需开发一类具有操作简单、方便快速、低成本且检测灵敏度高，检出限低的分析方法应用于HE4的早期分析检测。\n[0005] 近年来，上转换纳米粒子(UCNPs)由于其具有近红外(NIR)激发可见光区发射的特点，极大地减少了生物分子的自发背景荧光和光散射而在化学、生物医学等交叉领域备受关注。同时，基于UCNPs构建的上转换(UC)探针也被越来越多的应用于各种生物分子的检测。然而，由于UCNPs本身只能通过改变掺杂的稀土离子比来改变其发射波长，并且其表面没有任何识别单元，因此本身并未具有出色的传感行为。为克服上述技术缺陷，需要在UCNPs表面修饰合适的识别单元作为能量受体以构建能量转移体系，实现分析物的检测。截至目前为止，许多材料(如有机染料、贵金属纳米粒子和纳米簇、金属配合物、碳纳米及半导体纳米材料等)均已被证明是有效的能量受体。但是，基于上述材料构建的上转换纳米探针由于其发光强度低和相对较低的上转换效率而导致上转换探针在实际检测及分析中的灵敏度严重受限。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的主要是针对检测灵敏度较低的问题，提供一种基于上转换纳米材料与BHQ‑1间构建荧光共振能量转移体系应用于检测HE4的方法。首先通过溶剂热法合成了聚丙烯酸修饰的上转换纳米粒子并作为能量供体，再通过酰胺化反应将末端氨基修饰有猝灭基团BHQ‑1的适配体偶联至上转换纳米粒子的表面，并将其作为能量受体以构建具有共振能量转移特性的上转换纳米探针。最终，由于适配体对HE4的特异性识别作用，使适配体的构象发生改变，上转换纳米粒子和BHQ‑1之间的距离增大，从而使荧光共振能量转移过程被抑制或阻断，能量供体本身的荧光恢复，因此实现HE4的高灵敏度定量分析检测。\n[0007] 为实现上述检测效果，本发明采用的技术方案是：\n[0008] 一种基于上转换纳米材料与BHQ‑1共振能量转移检测人附睾蛋白4的方法，以水溶性上转换荧光纳米材料为能量供体，以猝灭剂BHQ‑1为能量受体，具体包括如下步骤：\n[0009] S1、制备水溶性上转换荧光纳米材料；\n[0010] S2、采用酰胺化反应，在水溶性上转换荧光纳米材料表面偶联5′端修饰有氨基，3′端修饰有BHQ‑1的癌抗原HE4适配体，得到上转换荧光探针；\n[0011] S3、制备已知癌抗原HE4浓度的检测体系，然后取步骤S2制得的上转换荧光探针分散于人体血清(为稀释的人体血清，优选用HEPES缓冲溶液(10 mM，pH＝7.2)稀释100倍)中，在980nm激光器下检测不同浓度的癌抗原HE4 溶液的荧光强度，得到标准曲线；\n[0012] S4、制备待测样品的检测体系，在980nm激光器下检测待测样品的荧光强度，根据S3得到的标准曲线求得待测样品中的HE4的浓度；\n[0013] 优选的，所述癌抗原HE4适配体的碱基序列为： (CACCATTATCGTACGACAGTCATCCTACACAATGGT)，其5′端修饰有氨基，3′端修饰有BHQ‑1。\n[0014] 优选的，所述S2具体操作为：\n[0015] 将S1的水溶性上转换荧光纳米材料分散到MES缓冲溶液(10mM，pH＝ 5.5)中；然后将1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶液和 N‑羟基硫代琥珀酰亚胺Sulfo‑NHS溶液加入到上述分散液中，接着将混合液在30‑45℃下孵育0.5‑2h(优选35℃下孵育1h)，离心，并将获得的沉淀物分散在含癌抗原HE4适配体的HEPES缓冲溶液(10mM，pH＝\n4‑8，最优选pH 为7.2)中；然后将混合物在30‑45℃下孵育10‑15h(优选35℃下孵育12h)，再将Tris‑HCl添加到混合物中以封闭多余的Sulfo‑NHS，离心，并用水洗涤，得到上转换荧光探针；\n[0016] 所述水溶性上转换荧光纳米材料与癌抗原HE4适配体的用量比为1mg：(0.1‑2)nmol，最优选为1mg：1nmol。\n[0017] 优选的，所述水溶性上转换荧光纳米材料与1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐溶液中EDC·HCl、N‑羟基硫代琥珀酰亚胺溶液中Sulfo‑NHS 的质量比为1：0.5：1。\n[0018] 优选的，所述水溶性上转换荧光纳米材料由如下方法制备得到：\n[0019] 1)以稀土氯化物为原料，油酸为配体，1‑十八烯为高温有机溶剂，采用高温溶剂热法合成油酸包裹的稀土上转换纳米粒子：\n[0020] 将稀土氯化物用浓盐酸溶解后加入三口烧瓶中，向其中加入NaF，再向其中加入油酸和1‑十八烯，在氩气保护下，加热搅拌(优选在100℃下搅拌1 h)，除去混合液中的水和氧，然后在280‑300℃下保持2‑4h(优选在295℃下保持2h)；再将混合液在200‑300℃下退火\n1‑3h(优选在240℃下退火1h)；冷却至室温后，离心、洗涤得到油酸包裹的稀土上转换纳米粒子，将上转换纳米粒子重新分散在环己烷中备用，用时从环己烷中离心分离；\n[0021] 2)采用在酸性环境下超声辅助乙醇法将稀土上转换纳米粒子表面包裹的油酸配体去除：\n[0022] 将无水乙醇和浓盐酸加入到步骤1)得到的油酸包裹的稀土上转换纳米粒子中，超声，然后离心，洗涤，得到裸露的上转换纳米颗粒；\n[0023] 3)采用表面配体交换法，使用聚丙烯酸对稀土上转换荧光纳米粒子进行水溶性修饰：\n[0024] 将步骤2)制得的裸露的上转换纳米颗粒加入到含聚丙烯酸(优选MW为 1800)的超纯水中，将混合液于室温下搅拌10‑20h，然后离心，洗涤，即制得聚丙烯酸包裹的上转换荧光纳米颗粒。\n[0025] 优选的，在步骤1)中，所述稀土氯化物为氯化钇、氯化镱和X元素氯化物的混合物，其中Y、Yb与X元素的摩尔比为(70～90)：(5～30)：(0.1～ 1)，更优选为79.8:20:0.2，其中X是Er或Tm。\n[0026] 优选的，所述步骤1)中稀土氯化物、NaF、油酸和1‑十八烯的用量比为1mmol：(10‑\n30)mmol：(2‑10)mL：(2‑20)mL，最优选为1mmol：20mmol： 6mL：6mL。\n[0027] 优选的，在步骤3)中，裸露的上转换纳米颗粒与聚丙烯酸的用量比为1mg： (3～6)nmol，最优选为1mg：5nmol。\n[0028] 优选的，步骤S3中，绘制标准曲线的具体操作是：取步骤S2制得的上转换荧光探针分散于人体血清中(所述人体血清为稀释了100倍的正常人体血清)，分成若干组，以其中一组混合液为空白样，向其余各组混合液中分别加入不同已知浓度的癌抗原HE4溶液，再置于室温下孵育10～90min；在980 nm激光器下测定各组混合液的上转换荧光强度，空白样的荧光强度为F0，加入HE4溶液后的各组混合液的荧光强度为F，以 为纵坐标，HE4溶液浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。\n[0029] 优选的，步骤S4中，制备样品检测体系的具体操作是：取步骤S2制得的上转换荧光探针，分散于HEPES缓冲溶液(10mM，pH＝7.2)中，然后向其中加入未知浓度的目标物样品(目标物优选为血清样品)，再置于室温下孵育 10～90min后，测定混合液的荧光强度Fx，计算 的值，代入步骤S3得到的标准曲线，计算得到样品中目标物的浓度。\n[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：\n[0031] (1)本发明首先通过溶剂热法合成了聚丙烯酸修饰的上转换纳米粒子作为能量供体，再通过酰胺化反应将末端氨基修饰有猝灭剂BHQ‑1的适配体偶联至上转换纳米粒子表面，作为能量受体，以构建共振能量转移上转换探针。由于存在荧光共振能量转移(FRET)效应，上转换纳米粒子的荧光被BHQ‑1 猝灭；当加入HE4后，目标物会与修饰有BHQ‑1的适配体结合，荧光共振能量转移效应被抑制，导致上转换纳米颗粒的荧光恢复。根据荧光恢复程度的不同，可实现对HE4的定量测定。本发明方法具有灵敏度高，特异性强，操作简便等特点，可很好的应用于卵巢恶性肿瘤的早期诊断。\n[0032] (2)本发明采用BHQ‑1作为荧光受体，其已经商业化，成本低廉，具有很好猝灭能量供体的能力，本方法不仅检测的灵敏度高，且在检测过程中无需进行生物标记，具有操作快速便捷等特点，对早期肿瘤标志物的诊断具有重要的临床意义。\n[0033] (3)本发明利用适配体对待测肿瘤标志物具有特异性识别的功能，提高了检测的准确性和稳定性；同时本发明利用激光诱导上转换荧光发射，检测的荧光信号背景低，从而大大提高了检测的灵敏度；且本发明利用荧光共振能量转移体系，简化了前处理步骤，缩短了检测时间。\n附图说明\n[0034] 图1为本发明上转换荧光纳米材料和BHQ‑1猝灭基团之间荧光共振能量转移检测癌抗原HE4的机理示意图。\n[0035] 图2中(a)为聚丙烯酸包裹的上转换纳米颗粒的透射电子显微镜表征图；图2中(b)为聚丙烯酸包裹的上转换纳米颗粒的粒径分布图；图2中(c)为聚丙烯酸包裹的上转换纳米颗粒的XRD谱图；图2中(d)为油酸包裹的上转换纳米颗粒、聚丙烯酸、裸露的上转换纳米颗粒和聚丙烯酸包裹的上转换纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱图。\n[0036] 图3中1为实施例2中癌抗原HE4适配体的紫外‑可见吸收光谱图 (1Aptamer‑BHQ‑\n1)，图3中2是上转换纳米颗粒溶液的紫外‑可见吸收光谱图(2UCNPs)，图3中3是适配体和上转换纳米颗粒偶联以后，即上转换荧光探针的紫外‑可见吸收光谱图(3UC‑Apt)。\n[0037] 图4为癌抗原HE4适配体的紫外‑可见吸收光谱与上转换纳米颗粒的荧光光谱图。\n[0038] 图5为实施例3中癌抗原HE4适配体的加入量对水溶性上转换纳米颗粒荧光猝灭的效率结果图。\n[0039] 图6为实施例3中UCNPs‑HE4 ampater‑BHQ‑1的相对荧光强度与癌抗原HE4适配体HE4 ampater‑BHQ‑1浓度的关系图。\n[0040] 图7和图8为实施例4中上转换荧光检测探针检测不同癌抗原HE4浓度的上转换荧光的影响结果图以及荧光变化量与癌抗原HE4浓度变化的线性关系图。\n[0041] 图9为实施例5中孵育时间对上转换荧光探针稳定性的影响结果图。\n[0042] 图10为实施例5中有荧光受体pH对上转换荧光探针稳定性的影响。\n[0043] 图11为实施例5中上转换荧光探针的特异性实验结果图。\n具体实施方式\n[0044] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，申请人结合以下实施例对本发明进行进一步详细说明；应当理解，此处所描述的具体实施例子仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明；除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。\n[0045] 以下实施例中，癌抗原HE4适配体为癌抗原HE4的特异性识别单元，其序列按照参考文献(Anal.Bioanal.Chem.,2015,407,6965–6973)：由Sangon Biotechnology Co.Ltd.(Shanghai,China；www.sangon.com)公司合成。\n[0046] 癌抗原HE4适配体(HE4 aptamer‑BHQ‑1)的碱基序列为： (CACCATTATCGTACGACAGTCATCCTACACAATGGT)，其5′端修饰有氨基，3′端修饰有BHQ‑1。\n[0047] 以下实施例中所有荧光检测所用光源均为980nm激光光源。\n[0048] 以下实施例中所用血清为将武汉大学人民医院提供的正常人体血清用 HEPES缓冲溶液(10mM，pH＝7.2)稀释100倍后投入使用。\n[0049] 下面通过具体的实施例子并结合说明书附图对本发明做进一步的详细描述。\n[0050] 实施例1\n[0051] 一种水溶性上转换荧光纳米材料的制备方法，包括如下步骤：\n[0052] 1)以稀土氯化物为原料，油酸为配体，1‑十八烯为溶剂，采用高温溶剂热法合成油酸包裹的稀土上转换纳米粒子，具体方法如下：\n[0053] a)稀土氯化物原料LnCl3采用空气浴法合成：\n[0054] 将6mmol由摩尔比79.8:20:0.2的Y2O3、Yb2O3和Er2O3组成的混合物加入到单口瓶中，向其中加入25mL浓盐酸(36wt％‑38wt％，下同)并加热至溶液澄清；随后升温将溶剂蒸干，冷却至室温；然后向其中同时加入超纯水、无水乙醇、正己烷，在70℃下加热5h，待冷却至室温后，用超纯水萃取三次，旋干溶剂，将产物溶于由油酸和1‑十八烯按照体积比为1:1的混合溶剂中，配置成0.25mol/L的Ln(oleate)3前驱液备用；\n[0055] b)采用溶剂热法制备油酸包裹的NaYF4：Yb，Er上转换纳米颗粒：\n[0056] 将1mmol步骤a)制备的Ln(oleate)3前驱液和20mmol NaF加入三口烧瓶中，再向其中加入6mL油酸和6mL 1‑十八烯，氩气保护下，将混合液升温至100℃，并在100℃下搅拌1h，以除去混合液中的水和氧，然后升温至295℃，病在295℃下保持2h；再用高温退火法，将混合液在240℃退火1h，以减少纳米颗粒表面的缺陷；冷却至室温后，离心收集所得的纳米颗粒，并用无水乙醇洗涤3次后得到油酸包裹的稀土上转换纳米粒子，接着将得到的上转换纳米粒子重新分散在环己烷中备用；\n[0057] 2)采用超声辅助乙醇法将稀土上转换纳米粒子表面包裹的油酸除去：\n[0058] 将步骤b)得到的上转换纳米粒子的环己烷溶液离心得到100mg油酸包裹的稀土上转换纳米粒子，向其中加入50mL无水乙醇和1mL浓盐酸，将溶液超声处理1.5h，然后离心，并用无水乙醇和水洗涤各洗三次，得到裸露的上转换纳米颗粒；\n[0059] 3)采用表面配体交换法，使用聚丙烯酸对稀土上转换荧光纳米粒子进行水溶性修饰：\n[0060] 将10mg步骤2)制得的裸露的上转换纳米颗粒加入到10mL含有50nmol 聚丙烯酸(MW 1800)的超纯水中，将混合液于室温下搅拌12h，然后离心，用水洗涤，制得聚丙烯酸包裹的上转换荧光纳米颗粒，即水溶性上转换荧光纳米材料。\n[0061] 图2中(a)为本实施例制得的聚丙烯酸包裹的上转换纳米颗粒的透射电子显微镜表征图，从图中结果可以看出，本实施例制得的水溶性的上转换荧光纳米颗粒呈球形，且分散均匀。\n[0062] 图2中(b)为本实施例制得的聚丙烯酸包裹的上转换纳米颗粒的粒径分布图，从图中结果可以看出，本实施例制得的水溶性的上转换纳米颗粒的平均粒径为44.6±0.5nm，且粒径分布均匀。\n[0063] 图2中(c)为本实施例制得的聚丙烯酸包裹的上转换纳米颗粒的XRD谱图，从图中结果可以看出，本发明制得的水溶性的上转换纳米颗粒为六方晶相，该测试结果与纯的六方相β‑NaYF4的JCPDS卡片No.16‑0334一致。由此表明本发明成功制备了水溶性的β‑NaYF4六方晶相上转换纳米颗粒。\n[0064] 图2中(d)从下至上依次为油酸包裹的上转换纳米颗粒、裸露的上转换纳米颗粒和‑1 ‑1\n聚丙烯酸包裹的上转换纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱图。其中， 2923cm 和2854cm 归‑1\n属于油酸包裹的上转换纳米颗粒上亚甲基的不对称和对称C–H键伸缩振动峰，1447cm 和‑1\n1563cm 为不对称和对称C＝O键伸缩振动峰，由此表明本发明成功制备了油酸包裹的上转换纳米颗粒；当通过超声剥离法除去上转换纳米颗粒表面上的油酸，油酸的特征吸收峰消‑1\n失；当进一步采用表面配体交换法对其进行聚丙烯酸改性后，上转换纳米粒子在 2920cm‑1\n处出现了亚甲基的不对称伸缩振动峰，并在1720cm 处出现了C＝O 的伸缩振动峰及由此表明聚丙烯酸已成功修饰至上转换纳米颗粒上。\n[0065] 实施例2\n[0066] 上转换荧光探针的制备：采用酰胺化反应，完成目标癌抗原HE4适配体在水溶性上转换荧光纳米材料表面的修饰，具体方法如下：\n[0067] 将100μL 10mg/mL的实施例1制得的水溶性上转换荧光纳米材料分散液(实施例1制备的聚丙烯酸包裹的上转换荧光纳米颗粒用超纯水分散得到) 加入到700μL MES缓冲溶液(10mM，pH＝5.5)中；然后将100uL 5mg/mL EDC溶液(1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶于MES 缓冲溶液(10mM，pH＝5.5)配制得到)和100uL 10mg/mL N‑羟基硫代琥珀酰亚胺溶液Sulfo‑NHS(MES缓冲溶液(10mM，pH＝5.5)配制)加入到上述溶液中，接着将混合液在35℃下孵育1h，以活化水溶性上转换荧光纳米材料上的羧基，离心收集活化后的水溶性上转换荧光纳米材料，并将获得的沉淀物分散在1mL含1nmoL癌抗原HE4适配体的HEPES缓冲溶液(10mM， pH＝7.2)中；然后将混合物在35℃下孵育12h，再将10mg Tris‑HCl添加到混合物中以封闭多余的Sulfo‑NHS。通过离心收集癌抗原HE4适配体修饰的上转换纳米颗粒，并用水洗涤，得到上转换荧光探针。最后，将产物重新分散在1mL HEPES缓冲溶液(10mM，pH＝7.2)中，得到浓度为1mg/mL的分散液，并于4℃保存备用。\n[0068] 图3为本实施例制得的癌抗原HE4适配体修饰的上转换纳米颗粒的紫外‑ 可见吸收光谱表征，图中1是适配体HE4 aptamer‑BHQ‑1的紫外‑可见吸收光谱图(1Aptamer‑BHQ‑\n1)，图中2是上转换纳米颗粒分散液的紫外‑可见吸收光谱图(2UCNPs)，图中3是适配体和上转换纳米颗粒偶联以后，即上转换荧光探针的紫外‑可见吸收光谱图(3UC‑Apt)。从图中结果可以看出，上转换荧光探针在263nm处出现了一个新的紫外吸收峰，其是癌抗原HE4适配体的特征吸收峰，由此表明癌抗原HE4适配体成功修饰至上转换纳米颗粒的表面。\n[0069] 图4为适配体HE4 aptamer‑BHQ‑1的紫外‑可见吸收光谱图和本实施例制得的上转换纳米颗粒的荧光光谱图(实线是上转换纳米颗粒的发射光谱图，虚线是适配体HE4 aptamer‑BHQ‑1的紫外‑可见吸收光谱图)，从图中结果可以看出，适配体的紫外吸收光谱在\n300～600nm之间具有较宽的吸收带，和上转换纳米颗粒的荧光发射光谱能够很好的重叠，满足发生FRET所需的光谱匹配要求，因此能够用于上转换探针的制备，并具有较高的上转换效率。\n[0070] 实施例3\n[0071] 为考察不同荧光受体浓度对荧光猝灭效率的影响，本实施例在实施例2 的基础上，分别将不同物质的量的HE4 aptamer‑BHQ‑1分散液加入到实施例1 制得的上转换纳米颗粒的缓冲液中，并于37℃下孵育1h，得到检测探针，然后在980nm激光器下测定各混合液的上转换荧光强度，得到荧光猝灭效率最大的混合液中所对应的上转换荧光探针浓度和荧光受体浓度。\n[0072] 图5、6为受体对水溶性上转换纳米颗粒荧光猝灭的效率结果图(空白样的荧光强度为F0，加入HE4 aptamer‑BHQ‑1分散液后的各组混合液的荧光强度为F)，从图中结果可以看出，当荧光受体浓度为1nmoL/mL时，上转换荧光探针的荧光猝灭效率达到82％，由此表明本发明制得的上转换荧光探针可以用于癌抗原HE4的高灵敏度检测。\n[0073] 实施例4\n[0074] 将实施例2制得的上转换荧光检测探针溶液用血清稀释20倍置于4摄氏度保存备用。分成等量的若干组，以其中一组检测探针溶液为空白样，向其余各组检测探针溶液中分别加入已知浓度的癌抗原HE4溶液(上海领潮生物科技有限公司)，再置于室温下孵育1h。在\n980nm激光器下测定各组混合液的上转换荧光强度，得到的上转换荧光光谱图见图7；并以空白样的荧光强度为F0，加入癌抗原HE4溶液后的各组混合液的荧光强度为F，以 为纵坐标，癌抗原HE4溶液浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线结果如图8所示。\n[0075] 图7表明本发明方法建立的检测方法能够对0.4‑18ng/mL浓度范围内的癌抗原HE4有所响应，且癌抗原HE4的浓度越大，荧光强度也越高。图8表明在0.4‑7ng/mL浓度范围内上转换探针的荧光恢复程度与癌抗原HE4浓度的对数呈现良好的线性关系，其线性方程为：\n[0076]\n[0077] ，检出限为0.023ng/ml。图7～8的结果表明，本发明基于水溶性上转换纳米颗粒荧光供体与末端修饰BHQ‑1的癌抗原HE4适配体荧光受体所建立的检测方法可以实现对血清中癌抗原HE4的高灵敏检测。\n[0078] 实施例5\n[0079] 为了考察本发明所制备的上转换探针的稳定性，本实施例选择在不加任何目标物的情况下，将实施例2制备好的探针置于HEPES缓冲溶液(10mM， pH＝7.2)中进行孵育。在\n980nm激光器下测定上转换探针不同孵育时间以及探针在不同pH环境下(不同pH的HEPES缓冲溶液中)的上转换荧光强度，结果如图9和10所示。从图中看出，随着孵育时间的延长及在pH＝4‑8范围内，本发明所制备的上转换探针的上转换强度保持稳定，几乎无明显的衰减现象。由此表明本发明所制备的上转换探针具有非常好的稳定性，可以用于血清中癌抗原HE4的高灵敏检测。\n[0080] 实施例6\n[0081] 抗干扰性能是衡量上转换探针的实用性的重要指标之一。为了考察本发明所制备的上转换探针对癌抗原HE4的特异性识别性能，本实施例选取了糖类抗原(CA125),抗坏血酸(AA)，半胱氨酸(Cys)，免疫球蛋白(IgG)，癌胚抗原(CEA)，糖类抗原19‑9(CA19‑9)，牛血清白蛋白(BSA)，甲胎蛋白(AFP)，胃泌素释放肽前体(Pro‑GRP)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，鳞状细胞癌抗原(SCCA)等作为干扰项进行选择性实验。\n[0082] 将实施例2制得的上转换荧光检测探针溶液用HEPES缓冲溶液(10mM， pH＝7.2)稀释20倍并分为等量的12份，向其中一份加入18ng/mL癌抗原HE4 溶液作为实验组，其他组分别加入100U/mL的糖类抗原125(CA125)和糖类抗原19‑9(CA19‑9)；100ng/mL的抗坏血酸(AA)，免疫球蛋白(IgG)，癌胚抗原(CEA)，牛血清白蛋白(BSA)，甲胎蛋白(AFP)，胃泌素释放肽前体  (Pro‑GRP)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，鳞状细胞癌抗原(SCCA)和半胱氨酸(Cys)作为干扰项进行选择性实验，并在相同条件下进行测试上转换荧光强度。结果如图11所示。\n[0083] 由图中结果可知：干扰物加入前后上转换探针的荧光强度值无明显变化。由此表明本发明基于水溶性上转换纳米颗粒荧光供体与BHQ‑1猝灭基团能量受体所建立的上转换检测探针对癌抗原HE4具有较高的选择性识别性能，能够用于血清中癌抗原HE4的特异性检测，有望用于临床上卵巢恶性肿瘤的早期诊断。\n[0084] 综上所述，本发明首先通过溶剂热法合成了聚丙烯酸修饰的上转换纳米粒子能量供体，再通过酰胺化反应将末端修饰有BHQ‑1的HE4适配体固载至上转换纳米粒子表面以构建上转换探针，由于荧光共振能量转移上转换荧光被BHQ‑1猝灭基团猝灭；当加入目标物后，目标物会增大BHQ‑1猝灭基团与上转换纳米粒子之间的距离，从而导致荧光共振能量转移被抑制，随即上转换纳米颗粒的荧光恢复，从而实现了对目标癌抗原HE4的高灵敏度测定。且在0.4‑7ng/mL浓度范围内上转换探针的荧光恢复程度与癌抗原HE4浓度的对数呈现良好的线性关系，其线性方程为：\n[0085] 检出限为0.023ng/ml。由此\n表明本发明检测方法具有操作简便，灵敏度高，特异性强等特点，有望用于临床上卵巢恶性肿瘤的早期诊断且具有较高的临床应用价值。\n[0086] 以上所述，仅为本发明的说明实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，做出的若干改进和补充也应视为本发明的保护范围；凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明精神和范围的情况下，利用以上所揭示的技术内容做出的些许更改、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所做的任何等同变化的更改、修饰与演变，均仍属于本发明的保护范围。