一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉及其制备方法

1.一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述的蛋白粉的制备方法如下：
1）原料预处理：
将鱼皮清洗，沥干鱼皮表面的水，然后将鱼皮粉碎；
2）酶解：
首先在粉碎的鱼皮中加入鱼皮重量20%的水，混匀后升温至55℃，调节pH7.0，然后加入鱼皮重量0.1-0.2%的酶A，55℃、pH7.0条件下酶解2-3小时；
酶A酶解结束后，降温至50℃，然后加入鱼皮重量0.05-0.1%的酶B，在pH7.0继续水解1-2小时；然后温度降为45℃，调节pH至7.5，加入鱼皮重量0.05-0.1%的酶C继续水解
2小时，全部水解结束后升温至95℃保持10分钟使酶灭活；所述的酶A为中性蛋白酶，所述的酶B为肽酶和风味酶的混合酶，其中肽酶和风味酶的质量比为1：4；酶C为胶原蛋白酶，是从保藏编号为CGMCC NO.7567的Bacillus subtilis菌中制备的；其制备方法如下：首先将Bacillus subtilis菌用LB培养基扩大培养制得种子液，然后将种子液接种到产酶培养基中，于37℃，200rpm培养48小时，培养结束后，在4℃条件下、10000rpm离心10min，收集发酵上清液；向发酵上清液中加入硫酸铵沉淀蛋白，然后在4℃离心收集沉淀，沉淀用清水溶解后超滤脱盐；向脱盐后的酶溶液加入麦芽糊精，最后冷冻干燥或喷雾干燥得到胶原蛋白酶；其中产酶培养基成分如下：葡萄糖20g/L，酵母提取物1.5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钙0.05g/L，氯化镁0.165g/L，磷酸氢二钾0.25g/L，磷酸二氢钠0.5g/L，pH7.5；
3）固液分离：
采用离心机在离心力10000g条件下对鱼皮酶解液离心20-30分钟，收集酶解上清液；
4）过滤处理：
将酶解上清液先采用0.2μm孔径的膜过滤，滤过液再采用截留分子量5000Da的超滤膜进行超滤，收集滤过液；
5）脱腥脱色：
向超滤的滤过液中加入滤液体积2-10%的活性炭粉末，在50-70℃温度下搅拌脱腥脱色30-60分钟，然后过滤除去活性炭粉末；
6）浓缩及干燥：
脱腥脱色的酶解液在55℃条件下采用减压浓缩至固形物含量为35%或以上，然后采用离心式喷雾干燥，得到富含胶原三肽的胶原蛋白粉。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的鱼皮为深海鳕鱼鱼皮或罗非鱼鱼皮。

一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉及其制备方法 \n技术领域\n[0001] 本发明属于生化技术领域，具体涉及一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉及其制备方法。 \n背景技术\n[0002] 在生物体内，胶原蛋白是由成纤细胞合成的一种生物高分子，其广泛地存在于动物骨、腱、软骨、皮及其他结缔组织中，是细胞外基质的结构蛋白质。胶原蛋白在细胞外基质中聚集为超分子结构，分子量为300KD左右，其最普遍的结构特征是三螺旋结构，其由3条α链多肽组成。每一条胶原链都是左手螺旋构型，3条左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构。独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等。 \n[0003] 胶原三肽（Collagen tripeptide）是胶原蛋白经胶原酶水解后的产物，是胶原蛋白的最小单元，其结构可以表示为（Gly-X-Y），是一种在N端带有甘氨酸的高纯度三肽，其分子量约为280Da，与普通胶原肽2000-3000Da的分子量相比，胶原三肽无需分解即可被人体吸收和利用。但目前利用蛋白酶酶解胶原蛋白来制备的胶原蛋白肽，其分子量不均一，而且具有独特胶原活性功能的胶原三肽含量很少，从而影响了胶原蛋白肽的生理活性功能。\n因此，有必要提供一种能够有效的制备富含胶原三肽的胶原蛋白粉的方法。 发明内容\n[0004] 本发明的目的是提供一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉及其该胶原蛋白粉的制备方法，本发明以鱼皮为原料，先采用复合蛋白酶对鱼皮胶原蛋白进行提取并降解成小分子肽，再利用自主筛选的胶原蛋白酶对小分子肽进一步定向降解成胶原三肽，然后经离心、脱腥脱色、浓缩、喷雾干燥获得富含胶原三肽的胶原蛋白粉。 \n[0005] 本发明先采用复合蛋白酶提取胶原蛋白，再采用筛选的胶原蛋白酶定向切割胶原蛋白三螺旋结构（Gly-X-Y）的甘氨酸与羟脯氨酸之间的肽键，从而获得富含胶原三肽的胶原蛋白粉，解决了采用常规复合蛋白酶降解胶原蛋白分子量不均一、生物活性功能低等缺点，显著提高胶原蛋白肽的美容养颜功效。 \n[0006] 本发明的富含胶原三肽的胶原蛋白粉，其制备方法如下： \n[0007] 1）原料预处理： \n[0008] 将鱼皮清洗，沥干鱼皮表面的水，然后将鱼皮粉碎； \n[0009] 2）酶解： \n[0010] 首先在粉碎的鱼皮中加入鱼皮重量20%的水，混匀后升温至55℃，调节pH7.0，然后加入鱼皮重量0.1-0.2%的酶A， 55℃、pH7.0条件下酶解2-3小时； \n[0011] 酶A酶解结束后，降温至50℃，然后加入鱼皮重量0.05-0.1%的酶B， 在pH7.0继续水解1-2小时； \n[0012] 然后温度降为45℃，调节pH至7.5，加入鱼皮重量0.05-0.1%的酶C继续水解2小时，全部水解结束后升温至95℃保持10分钟使酶灭活； \n[0013] 3）固液分离： \n[0014] 采用离心机在离心力10000g条件下对鱼皮酶解液离心20-30分钟，收集酶解上清液； \n[0015] 4）过滤处理： \n[0016] 将酶解上清液先采用0.2µm孔径的膜过滤，滤过液再采用截留分子量5000Da的超滤膜进行超滤，收集滤过液； \n[0017] 5）脱腥脱色： \n[0018] 向超滤的滤过液中加入滤液体积2-10%的活性炭粉末，在50-70℃温度下搅拌脱腥脱色30-60分钟，然后过滤除去活性炭粉末； \n[0019] 6）浓缩及干燥： \n[0020] 脱腥脱色的酶解液在55℃条件下采用减压浓缩至固形物含量为35%或以上，然后采用离心式喷雾干燥，得到富含胶原三肽的胶原蛋白粉。 \n[0021] 本发明所使用的酶A为中性蛋白酶， \n[0022] 酶B为肽酶和风味酶的混合酶，其中肽酶和风味酶的质量比为1：4； [0023] 本发明中所使用的酶C为胶原蛋白酶，是从保藏编号为CGMCC NO.7567的Bacillus subtilis菌中制备的；其制备方法如下：首先将Bacillus subtilis菌用LB培养基扩大培养制得种子液，然后将种子液接种到产酶培养基中，于37℃，200rpm培养48小时，培养结束后，在4℃条件下、10000rpm离心10min，收集发酵上清液；向发酵上清液中加入硫酸铵沉淀蛋白，然后在4℃离心收集沉淀，沉淀用清水溶解后超滤脱盐；向脱盐后的酶溶液加入麦芽糊精，最后冷冻干燥或喷雾干燥得到胶原蛋白酶。 \n[0024] 其中产酶培养基成分如下：葡萄糖 20g/L，酵母提取物1.5 g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钙 0.05 g/L，氯化镁0.165 g/L，磷酸氢二钾0.25 g/L，磷酸二氢钠 0.5 g/L，pH 7.5 [0025] 本发明所用的鱼皮优选为深海鳕鱼鱼皮或罗非鱼鱼皮。 \n[0026] 本发明选用脂肪含量低的鱼皮为原料，在制备工艺中省去稀碱溶液浸泡脱除脂肪，减少因酸碱处理而产生的有害物质；另外，采用市售的蛋白酶、风味酶对鱼皮进行酶解后，再采用自制的胶原蛋白酶进一步将部分蛋白肽降解成胶原三肽，不仅可以提高原料中胶原蛋白的抽提率而且还显著提高胶原蛋白粉的功能性。 \n附图说明\n[0027] 图1：鳕鱼皮经本发明方法制备的胶原蛋白粉的分子量分布图。 具体实施方式\n[0028] 本发明中所用的中性蛋白酶其主要功能是将原料中的胶原蛋白抽提出来并降解成小分子肽，可以选用诺维信（中国）生物技术有限公司制备的中性蛋白酶，肽酶和风味酶可以购自天野酶制品株式会社；而胶原蛋白酶是从保藏编号为CGMCC NO.7567的Bacillus subtilis菌中制备的。申请人对于酶的种类以及添加的先后顺序进行了长期的研究，从而促成了本发明。 \n[0029] 对于胶原蛋白酶的制备方法，一种操作如下：选用LB培养基（LB培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L），调节pH为7.5，在37℃，200rpm对Bacillus subtilis CGMCC NO.7567进行扩大培养24小时时停止培养，制得种子液。取\n250ml种子液接种到5L产酶培养基中（产酶培养基成分如下：葡萄糖 20g/L，酵母提取物\n1.5 g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钙 0.05 g/L，氯化镁0.165 g/L，磷酸氢二钾0.25 g/L，磷酸二氢钠 0.5 g/L，pH 7.5。），于37℃，200rpm培养48小时，培养结束后，在4℃条件下、\n10000rpm离心10min，收集发酵上清液。向发酵上清液中缓慢加入研磨的硫酸铵粉末沉淀蛋白，然后在4℃离心收集沉淀，沉淀用清水溶解后超滤脱盐。向脱盐后的酶溶液加入麦芽糊精，最后冷冻干燥或喷雾干燥得到胶原蛋白酶，放置4℃保存。 \n[0030] 实施例1 \n[0031] 将鳕鱼鱼皮解冻后清洗除杂，称取沥干表面水分的鱼皮5kg，然后用小型绞碎机将鱼皮绞碎后装入10L的酶解反应釜中，加入1kg的水，搅拌混匀。 \n[0032] 升温至55℃，用5M的氢氧化钠调节pH至7.0，然后加入5g中性蛋白酶，维持55℃、pH7.0酶解2小时。降温至50℃，再加入2.5g肽酶和风味酶的复合物（其中肽酶0.5g，风味酶2.0g）， 在pH7.0条件下酶解2小时。 \n[0033] 将酶解液调节pH至7.5，混匀后分成6份，每份1kg，每份中加入0.5g自制的胶原蛋白酶，在45℃条件下，分别水解0、1、2、3、4、5小时。 \n[0034] 酶解结束后升温至95℃保温10分钟使酶灭活。倒出酶解液，酶解液分别在 离心力10000g条件下离心30分钟，收集酶解上清液。得到酶解上清液先采用孔径0.2µm不锈钢膜分离设备进行微滤，收集滤过液；微滤的滤过液再采用截留分子量为5000Da的不锈钢膜进行超滤，收集超滤的滤过液，得到超滤液890mL。向超滤液中加入50g活性炭粉末，60℃保温并搅拌30分钟，然后过滤去除活性炭粉末。得到的脱腥脱色液采用冷冻干燥得到类白色粉末。计算产物收率、蛋白含量，平均分子量以及胶原三肽含量，结果如下表： [0035] \n[0036] 实施例2 \n[0037] 将鳕鱼鱼皮解冻后清洗除杂，称取沥干表面水分的鱼皮10kg，然后用小型绞碎机将鱼皮绞碎后装入20L的酶解反应釜中，加入2kg的水，搅拌混匀。 \n[0038] 升温至55℃，用5M的氢氧化钠调节pH至7.0，然后加入10g中性蛋白酶，维持\n55℃、pH7.0酶解2小时。降温至50℃，再加入5g肽酶和风味酶的复合物，在 pH7.0条件下酶解2小时。降温至45℃、调节pH至7.5，再加入5g自制的胶原蛋白酶继续酶解2小时。 [0039] 酶解结束后升温至95℃保温10分钟使酶灭活。倒出酶解液，酶解液在离心力\n10000g条件下离心30分钟，得到酶解上清液约11L。得到酶解上清液先采用孔径0.2µm不锈钢膜分离设备进行微滤，收集滤过液；微滤的滤过液再采用截留分子量为5000Da的不锈钢膜进行超滤，收集超滤的滤过液，得到超滤液10.6L。向超滤液中加入400g活性炭粉末，\n60℃保温并搅拌30分钟，然后过滤去除活性炭粉末。得到的脱腥脱色液采用减压浓缩至体积4L，操作温度55℃，真空度0.098Mpa。然后采用小型喷雾干燥机对酶解浓缩液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进口温度170-175℃，出口温度85-90℃。最后得到富含胶原三肽的胶原蛋白粉约1.5kg，采用微量凯氏定氮法测得其蛋白含量93.7%，采用MODLI-TOF MS对胶原蛋白粉分子量分析及分子量分布，其平均分子量为800Da，其中分子量为280Da的胶原三肽含量12%以上（图1）。 \n[0040] 本发明突破胶原蛋白粉制备的常规酶组合，先采用市售的蛋白酶、肽酶及风味酶对原料中的胶原蛋白进行有效提取并降解成小分子肽，然后采用自主筛选的高活性的食品级胶原蛋白酶进一步将小分子肽定向降解成胶原三肽，不仅有效提高原料中胶原蛋白的抽提率，更重要的是通过该工艺制备得到的胶原蛋白粉中胶原三肽含量显著提高，使得产品的生物活性功能大大提高，从而提高产品的附加值。