局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂

1.通式(1)所示苯并二氢吡喃醇配糖体用于制造预防和/或治 疗局部缺血再灌注障碍的药物的用途

式中R1、R2、R3和R4相同或不同，各表示氢原子或C1-C6烷基，R5 表示氢原子，X表示单糖残基，n是1，和m是1。
2.按照权利要求1所述的用途，其中所述苯并二氢吡喃醇配糖 体为2-(α-D-吡喃型葡萄糖基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二 氢吡喃-6-醇。
3.按照权利要求1或2所述的用途，其中所述局部缺血再灌注 障碍为小肠粘膜障碍或脑局部缺血再灌注障碍。
4.按照权利要求1或2所述的用途，其中该药物呈水基制剂。

技术领域\n本发明涉及新型局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂。更具体地说， 涉及以水溶性苯并二氢吡喃醇配糖体为有效成分的局部缺血再灌流障 碍预防和治疗剂。\n背景技术\n人体细胞或组织，若长时间处于局部缺血状态，就会受到严重损 害，最终导致细胞死亡。另一方面，在通过一定时间的局部缺血再灌 流来急激增加氧负荷的情况下，会引起更加严重的障碍。这样的局部 缺血再灌流障碍，以前是作为临床上对器官移植或心肌硬塞进行冠状 血管再造术时可以看到的疾病来认识的，但自从近年来有人指出用猫 小肠进行局部缺血再灌流而引起的组织障碍中与自由基反应有关以来 (Granger，D.N.等人：猫小肠局部缺血中的超氧化物自由基， Gastroenterol，22-29，1981)，这个领域的研究已经扩大了，不仅涉 及小肠，而且也有涉及脑、心脏、胃、肝脏、肾脏等的局部缺血再灌 流障碍与活泼氧自由基的关系的报告。在这一方面，虽然从通过给药 外因性自由基清除剂能否减轻病态的观点来看许多研究正在取得进 展，但还有体内动态和反应场等各种各样的问题，还不能说只要有自 由基清除剂就能有效地抑制局部缺血再灌流引起的组织障碍(一守康 史等人：提到了关于再灌流障碍与自由基的问题，J.Act.Oxyg.Free Rad.：757-766，1991)。而且，这件事，从自由基清除剂作为医药 品还没有达到几乎受认可的现状来看，也是显而易见的。\n另一方面，本发明中使用的苯并二氢吡喃醇配糖体是已知化合物 (特开平7-118287号公报)。该苯并二氢吡喃醇配糖体是代表性的 维生素E即α-生育酚的苯并二氢吡喃环的2位植基用醇取代再与糖结 合而得到的，因而有高水溶性和优异的抗氧化作用。但是，该苯并二 氢吡喃醇配糖体用于局部缺血再灌流障碍的预防和治疗是未知的。\n本发明就是针对上述先有技术上存在的问题，其目的是提供一种 不伴随副作用且用量少就能有效起作用、能预防局部缺血再灌流所引 起的各种障碍、或者能改善、治愈病态的新型局部缺血再灌流障碍预 防和治疗剂。\n本发明的另一个目的是提供一种有优异抗氧化作用、能有效地抑 制、调节各种脏器的局部缺血再灌流障碍患部的自由基反应的、新型 局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂。\n本发明的又一个目的是提供一种能制成以高浓度含有有效成分的 水基制剂的新型局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂。\n发明公开\n本发明者等人，就局部缺血再灌流障碍的预防和治疗剂反复进行 锐意研究的结果，发现上述苯并二氢吡喃醇配糖体能剧烈地预防和改 善局部缺血再灌流障碍的病变，从而完成本发明。\n即，本发明是以下述通式(1)所示苯并二氢吡喃醇配糖体为有效 成分的局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂\n\n〔但式中R1、R2、R3和R4相同或不同，各表示氢原子或低级烷基，R5 表示氢原子、低级烷基或低级酰基，X表示糖残基中羟基的氢原子也 可以有低级烷基或低级酰基取代的单糖残基或寡糖残基，n是0～6的 整数，和m是1～6的整数〕。\n本发明也是上述苯并二氢吡喃醇配糖体为2-(α-D-吡喃型葡 萄糖基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-6-醇的上述局部缺 血再灌流障碍预防和治疗剂。\n本发明还是上述局部缺血再灌流障碍为小肠粘膜障碍或脑局部缺 血再灌流障碍的上述局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂。\n本发明又是水基制剂的上述局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂。\n实施本发明的最佳形态\n本发明的局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂的特征在于以上述通 式(1)所示苯并二氢吡喃醇配糖体为有效成分。\n上述通式(1)中，R1、R2、R3、R4和R5的低级烷基，可以是碳 原子数1～8、较好1～6的低级烷基，例如，可以列举甲基、乙基、丙 基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基、庚基、辛基等。 这些基团中，较好的是甲基或乙基。而且，作为R5的低级酰基，可以 是碳原子数1～8、较好1～6的低级酰基，例如，可以列举甲酰基、乙 酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、 己酰基、庚酰基、辛酰基等。这些基团中，较好的是乙酰基、丙酰基 或丁酰基。此外，作为X的单糖残基，可以列举葡萄糖、半乳糖、岩 藻糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、来苏糖、核糖、阿 洛糖、阿卓糖、艾杜糖、塔罗糖、脱氧核糖、2-脱氧核糖、奎诺糖、 阿比可糖等的糖残基。作为X的寡糖残基，可以列举2～4个上述单糖 结合而成者，例如麦芽糖、乳糖、纤维素二糖、棉子糖、木二糖、蔗 糖的糖残基。这些当中，较好的是葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、 鼠李糖、甘露糖、果糖等的单糖残基。而且，X的糖残基中羟基的氢 原子也可以有低级烷基、较好碳原子数1～8的低级烷基、或者低级酰 基、较好碳原子数1～10的低级酰基取代。进而，n为0～6、较好1～ 4的整数，m为1～6、较好1～3的整数。作为通式(1)所示苯并二 氢吡喃醇配糖体的较好实例，可以列举2-(α-D-吡喃型葡萄糖基) 甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-6-醇、2-(β-D-吡喃型 半乳糖基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-6-醇、2-(β-L -吡喃型岩藻糖基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-6-醇、2 -(α-L-吡喃型鼠李糖基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃- 6-醇、2-(β-D-吡喃型木糖基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二 氢吡喃-6-醇、2-(β-D-吡喃型葡萄糖基)甲基-2，5，7，8-四 甲基苯并二氢吡喃-6-醇、2-(β-D-吡喃型果糖基)甲基-2，5，7， 8-四甲基苯并二氢吡喃-6-醇、2-(α-D-吡喃型甘露糖基)甲 基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-6-醇等。\n本发明中使用的苯并二氢吡喃醇配糖体可以按照诸如特开平7- 118287号公报中记载的方法，在下述通式(2)\n\n(但式中R1、R2、R3、R4、R5和n是与上述同义的)所示2-取代醇 和能催化寡糖类、可溶性淀粉、淀粉或环糊精发生相应糖转位作用的 酶的存在下反应，并通过包括使糖的特定羟基特异性地与2-取代醇的 2位羟基结合在内的酶反应来制造(酶法)。\n上述反应中，作为原料使用的通式(2)所示2-取代醇(以下简 称“2-取代醇”)是众所周知的物质，可以按照诸如特公平1-43755 号公报或特公平1-49135号公报等中公开的方法得到。而且，例如， 通式(2)中R1、R2、R3和R4为甲基、R5为氢原子、n为1的2-取代 醇，通过在氢化铝锂的存在下，在二乙醚中，使トロロツクス加热回流 处理等，就可以容易地得到。\n上述反应中使用的、能催化糖转位作用的酶，因各该反应中所用 糖的种类而异，较好能像以下那样灵活运用。\n(1)2-取代醇中α-键上结合葡萄糖残基的情况：\n(a)对于从麦芽糖到麦芽四糖级的麦芽寡糖来说，较好以α-葡 糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20)起作用。作为α-葡糖苷酶， 可以几乎完全采用其起源由来物，具体地说，可以列举来源于东洋纺 织株式会社制酵母属(Saccharomyces sp.)的α-葡糖苷酶、来源于东 方人酵母工业株式会社制啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α- 葡糖苷酶、来源于天野制药株式会社制黑曲霉(Aspergillus niger)的 α-葡糖苷酶、来源于和光纯药工业株式会社制酵母属(Saccharomyses sp.)的α-葡糖苷酶、来源于SIGMA公司制面包酵母的α-葡糖苷酶、 来源于芽孢杆菌属(Bacillus)的α-葡糖苷酶等。\n(b)对于可溶性淀粉或淀粉来说，较好以4-α-葡聚糖转移酶 (4-α-D-glucanotransferase，EC 2.4.1.25)起作用。\n(2)2-取代醇中α-键上结合葡萄糖残基或麦芽寡糖残基的情 况：\n对于麦芽寡糖、可溶性淀粉、淀粉或环糊精(α、β、γ)等来说， 较好以环糊精葡聚糖转移酶(cyclodextrin glucanotransferase，EC 2.4.1. 19)起作用。作为代表性实例，可以列举来源于天野制药株式会社制 软化芽孢杆菌(Bacillus macerans)的环糊精葡聚糖转移酶、来源于 株式会社林原生物化学研究所制嗜热硬脂芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的环糊精葡聚糖转移酶，以及来源于巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)、环状芽孢杆菌ATCC 9995(Bacillus circulans ATCC 9995)的环糊精葡聚糖转移酶等。\n(3)2-取代醇中β-键上结合葡萄糖残基的情况：\n(a)对于纤维二糖、卡杜兰或昆布多糖等包含β-键的寡糖来说， 较好以β-葡糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)起作用。\n(b)对于磷酸存在下的纤维二糖来说，较好以纤维二糖磷酸化酶 (cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20)起作用。\n(4)2-取代醇中α-键上结合半乳糖残基的情况：\n(a)对于蜜二糖或棉子糖(蜜三糖)来说，较好以α-半乳糖苷 酶(α-galactosidase，EC 3.2.1.22)起作用。\n(5)2-取代醇中β-键上结合半乳糖残基的情况：\n(a)对于乳糖等来说，较好以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC 3.2.1.23)起作用。\n(b)对于阿拉伯半乳聚糖等来说，较好以内切-1，4-β-半乳聚 糖酶(Endo-1，4-β-galactanase，EC 3.2.1.89)起作用。\n(6)2-取代醇中β-键上结合果糖残基的情况：\n(a)对于蔗糖、棉子糖或蜜二糖等来说，较好以果聚糖蔗糖酶 (levansucrase，EC 2.4.1.10)起作用。\n(b)对于蔗糖来说，较好以β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase， EC 3.2.1.26)起作用。\n(c)对于菊粉等来说，较好以菊粉果糖转移酶(inulin fructotransferase，EC 2.4.1.93)起作用。\n上述反应中的反应条件因所使用的苯并二氢吡喃醇配糖体或酶的 种类而异，例如，在用α-葡糖苷酶合成通式(1)中m为1的苯并二 氢吡喃醇配糖体的情况下，较好把2-取代醇溶解在糖溶液中。为此， 较好添加有机溶剂，例如，可以列举二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰 胺、甲醇、乙醇、丙酮、和乙腈等，如果考虑到提高α-葡糖苷酶的转 移活性这一点，则较好能使用二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺。有 机溶剂的添加浓度为1～50％(体积)，如果考虑到反应效率，则较好 是5～35％(体积)。\n2-取代醇的浓度，较好在反应液中是饱和浓度或与其相近的浓 度。所用糖的种类可以是麦芽糖到麦芽四糖这样的低分子糖，较好的 是麦芽糖。糖的浓度是1～70％(重量/体积)、较好是30～60％(重 量/体积)。pH是4.5～7.5、较好是5.0～6.5。反应温度是10～70℃、 较好是30～60℃。反应时间是1～40小时、较好是2～24小时。但这 些条件当然会受到所使用酶的数量等的影响。反应结束后，反应液通 过用XAD(ORGANO株式会社)作为载体的柱色谱法处理，可以以 高纯度得到目标苯并二氢吡喃醇配糖体。\n此外，例如，作为在用环糊精葡聚糖转移酶合成通式(1)中m 为1的苯并二氢吡喃醇配糖体的情况下的反应条件，较好是使2-取代 醇溶解在糖溶液中。为此，较好添加有机溶剂，可以列举二甲基亚砜、 N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、丙酮和乙腈等。所添加有机溶剂 的浓度是1～50％(体积)，若考虑到反应效率，则较好是5～35％(体 积)。2-取代醇的浓度，较好在反应液中是饱和浓度或与此相近的高 浓度。\n作为上述反应中所采用的糖的种类，较好可以列举具有麦芽三糖 以上聚合度的麦芽寡糖、可溶性淀粉、淀粉和环糊精(α、β、γ)等。 糖的浓度是1～70％(重量/体积)、较好是5～50％(重量/体积)。pH 是4.5～8.5、较好是5.0～7.5。反应温度是10～70℃、较好是30～60 ℃。反应时间是1～60小时、较好2～50小时。但这些条件受所使用 酶的数量影响。通过这样的反应而得到的苯并二氢吡喃醇配糖体是m 为1～8的混合物。因此，这种混合物用葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)处 理时，只能得到通式(1)中m为1的苯并二氢吡喃醇配糖体。此时的 反应温度为20～70℃、较好30～60℃，反应时间是0.1～40小时、较 好1～24小时。但这些条件受所使用酶的数量影响。然后，将上述葡 糖淀粉酶处理后的溶液通过用XAD(ORGANO株式会社)作为载体 的柱色谱法处理，就能以高纯度得到通式(1)中m为1的苯并二氢吡 喃醇配糖体。\n在得到通式(1)中m为2的苯并二氢吡喃醇配糖体的情况下， 在与上述同样的条件下，用环糊精葡聚糖转移酶得到的、具有通式(1) 中m为1～8的混合物的形态的苯并二氢吡喃醇配糖体以β-淀粉酶 (EC3.2.1.2)作用，只能得到通式(1)中m为1或2的苯并二氢吡 喃醇配糖体。此时的反应温度是20～70℃、较好是30～60℃，反应时 间是0.1～40小时、较好是1～24小时。但这些条件受所使用酶的数量 影响。β-淀粉酶处理后的溶液通过用XAD(ORGANO株式会社)作 为载体的柱色谱法处理，能以高纯度得到通式(1)中m为2的苯并二 氢吡喃醇配糖体，与此同时，还能得到通式(1)中m为1的苯并二氢 吡喃醇配糖体。\n在得到通式(1)中m为3以上的苯并二氢吡喃醇配糖体的情况 下，在与上述同样的条件下，用环糊精葡聚糖转移酶得到的、具有通 式(1)中m为1～8的混合物的形态的苯并二氢吡喃醇配糖体通过用 配备HPLC的分级色谱法处理，就可以得到各m值的高纯度苯并二氢 吡喃醇配糖体。\n上述实施形态中，记载了以葡萄糖残基或麦芽寡糖残基作为糖残 基与2-取代醇结合的情况下的形态，但以半乳糖残基、β-葡萄糖残 基、甘露糖残基、果糖残基等作为糖残基与2-取代醇结合的形态也可 以较好地用于本发明中。在这样的形态中，除分别使用在催化上述糖 转位作用的酶项中所说明的恰当酶外，通过进行与上述实施形态同样 的操作，就可以得到高纯度的目标苯并二氢吡喃醇配糖体(特开平9- 249688号公报、特愿平9-176174号)。\n另一方面，本发明中使用的苯并二氢吡喃醇配糖体，也可以通过 使按照特愿平10-75599号公报中记载的方法，用保护基保护了上述2 -取代醇的6位羟基的衍生物(以下称“糖受体”)，与在端基位引 进了离去基团且用保护基保护了另一个羟基的糖衍生物(以下称“糖 供体”)发生缩合反应来制造(有机合成法)。\n作为能保护上述反应中使用的糖受体的6位羟基的保护基，可以 列举乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、氯乙酰基、乙酰丙酰基、苄基、 对甲氧基苄基、烯丙基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅 烷基、三甲基甲硅烷基和三苯甲基等，特别好的是乙酰基和苯甲酰基。\n作为上述反应中所使用的糖供体的端基位上导入的离去基团，可 以列举氯、溴或氟等卤素原子，硫甲基、硫乙基或硫苯基等含硫化合 物、和三氯乙酰亚胺基等，特别好的是溴、氯、硫甲基、硫乙基、硫 苯基和三氯乙酰亚胺基。此外，作为保护除端基位以外的羟基的保护 基，可以列举乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、氯乙酰基和乙酰丙酰基 等酰基类保护基，和苄基、对甲氧基苄基、烯丙基、叔丁基二甲基甲 硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基和三苯甲基等醚类 保护基，其中较好的是酰基类保护基、特别好的是乙酰基。\n这些糖供体，用众所周知的方法给糖的全部羟基引进保护基，然 后把端基位置换成离去基团，就可以容易地制备。\n关于上述糖受体与糖供体的缩合反应，首先，把糖受体与糖供体 溶解在非极性溶剂中。糖受体和糖供体的加入量，糖供体对糖受体的 摩尔比是1.0～1.5、较好是1.1～1.3。作为非极性溶剂，可以列举二氯 甲烷、苯等。\n然后，在无水条件下，在活化剂的存在下，进行糖供体与糖受体 的缩合反应。作为活化剂，可以列举三氟化硼-醚配合物、过氯酸银、 三氟甲磺酸银、溴化汞、氰化汞、N-碘琥珀酰亚胺-三氟甲磺酸、三 氟甲磺酸二甲基甲硫基锍鎓、对甲苯磺酸等，尤其在使用溴作为糖衍 生物的离去基团的情况下，较好使用过氯酸银等重金属盐。反应温度 是5～30℃、较好10～25℃，反应时间12～48小时、较好20～30小 时。\n然后，所得到的反应物用硅胶柱色谱法等精制，用氢氧化钠和甲 醇-盐酸等使保护基脱保护，就可以得到2-(β-L-吡喃型岩藻糖 基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-6-醇、2-(α-L-吡喃 型鼠李糖基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-6-醇、2-(β -D-吡喃型木糖基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-6-醇等 (特愿平10-75599号)。\n用上述酶法或有机合成法得到的苯并二氢吡喃醇配糖体，一般具 有极高的水溶性(约100g/100ml)，而且也是富于油溶性(辛醇/水分 配系数＞3)的亲油亲水性分子。换言之，按照本发明的苯并二氢吡喃 醇配糖体，可以说是具有高亲脂性的水溶性维生素E。因此，按照本 发明的苯并二氢吡喃醇配糖体，不同于先有技术上不溶于或不良溶于 水的维生素E衍生物，即使溶于水中使用也能保持高亲脂性，因而可 以透过细胞膜、进而进入细胞内，从而增强了生物体内的抗氧化防御 体系，有效地抑制、调节局部缺血再灌流障碍患部中的活性氧和自由 基，预防局部缺血再灌流障碍，或大幅度改善局部缺血再灌流障碍的 病态。而且，上述反应得到的苯并二氢吡喃醇配糖体，即使就热稳定 性和pH稳定性而言，与生育酚(即维生素E)、トロロツクス或2- 取代醇相比，也有显著提高。\n本发明的局部缺血再灌流障碍的预防和治疗剂，可以使上述苯并 二氢吡喃醇配糖体与医药上可接受的载体配合或者溶解或悬浮在医药 上可接受的溶剂中而制成组合物，再经口或非经口地对患者给药。\n本药剂在用于经口给药的情况下，可使上述苯并二氢吡喃醇配糖 体与适当添加剂，例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、合成或天 然橡胶、结晶纤维素等赋形剂，淀粉、纤维素衍生物、阿拉伯胶、明 胶、聚乙烯基吡咯烷酮等粘结剂，羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、 淀粉、玉米淀粉、藻酸钠等崩解剂，滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钠等润 滑剂，碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸钠等填充剂或稀释剂等适当混 合，制成片剂、散剂(粉末剂)、丸剂、和颗粒剂等固形制剂。而且， 也可以用硬质或软质明胶胶囊等制成胶囊剂。对这些固形制剂，也可 以用羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸酯琥珀 酸酯、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸酯共聚物等包衣用基 剂实施肠溶性包衣。进而，上述苯并二氢吡喃醇配糖体也可以通过溶 解在精制水等一般使用的惰性稀释剂中，必要时向此溶液中适当添加 湿润剂、乳化剂、分散助剂、表面活性剂、增甜剂、矫味矫臭剂、芳 香物质等，制成糖浆剂、酏剂等液态制剂。\n此外，本发明的局部缺血再灌流障碍的预防和治疗剂在非经口给 药用的情况下，可以使上述苯并二氢吡喃醇与精制水，磷酸缓冲液等 适当缓冲液，生理食盐水、林格氏溶液、洛克氏溶液等生理盐类溶液， 乙醇、甘油和惯用表面活性剂等适当组合，而制成无菌的水溶液、非 水溶液、悬浮液、脂质体或乳液，较好制成注射用、输注用或喷雾用 无菌水溶液，经静脉内、皮下、肌肉内、腹腔内、肠内、支气管内等 给药。此时，液态制剂较好有生理学上的pH、更好在6～8范围内的pH。 进而，本发明的局部缺血再灌流障碍的预防和治疗剂也可以借助于植 入片埋入、或用栓剂用基剂制成栓剂再给药。\n上述中，较好的制剂或给药形态等由主治医生选择。\n本发明局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂中所含苯并二氢吡喃醇 配糖体的浓度因给药形态、疾病的种类或严重程度、或目标给药量等 而异，但一般来说，相对于原料总重量而言，是0.1～100％(重量)、 较好1～90％(重量)。具体地说，本发明制剂在经口给药的情况下， 相对于原料总重量而言是1～100％(重量)、较好5～90％(重量)； 在非经口给药的情况下，相对于原料总体积而言是0.1～90％(体积)、 较好1～80％(体积)。此时，苯并二氢吡喃醇配糖体的浓度若超过上 述上限值则不能达到与过剩给药量相称的病态改善效果，而若低于上 述下限值则不能充分期待病态改善效果，因而都不好。\n本发明局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂的上述给药量因患者的 年龄、体重和症状、目标给药形态或方法、治疗效果、处置延续时间 等而异，正确量要由医生决定，但通常本剂在经口给药的情况下，以 苯并二氢吡喃醇配糖体给药量计，给药量范围为0.1～10000mg/kg体 重/日，1日分1～3次给药。此时，在每1日经口给药量多的情况下， 也可以一次给药多个片剂等制剂。而且，在本发明局部缺血再灌流障 碍预防和治疗剂非经口给药的情况下，以苯并二氢吡喃醇配糖体的给 药量计，给药量为0.01～1000mg/kg体重/日，1日分1～3次给药。\n本发明局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂，可以用来预防和治疗 局部缺血再灌流引起的心脏、胃、小肠、肝脏、胰脏、肾脏、脑、眼 球、皮肤等各部位的障碍或脏器移植等中的各种障碍。具体地说，包 括脑局部缺血再灌流障碍或心肌局部缺血再灌流障碍等，脑梗塞、心 肌梗塞、肺梗塞等各种梗塞中的血流重建时、心肺分流形成术时、脏 器移植时等产生的障碍，小肠粘膜障碍等起因于应激反应等的消化道 粘膜或眼球表面等的微循环障碍等。上述脑局部缺血再灌流障碍包括 局部缺血性脑浮肿等，上述心肌局部缺血再灌流障碍包括冠状动脉痉 挛(spasm)解除或血栓溶解引起的血流再开通后所看到的心室性不规 则脉搏，梗塞组织内出血引起的心脏破裂，心脏手术时遭遇的人工心 肺脱离后心脏机能恢复不全或心肌震昏(stunned myocardium)等。\n药理试验\n以下通过用动物进行的药理试验，更详细地说明本发明局部缺血 再灌流障碍预防和治疗剂的药理效果。\n在各药理试验中，作为苯并二氢吡喃醇配糖体，采用的是按照特 开平7-118287号公报实施例1中记载的方法制造的以下式(3)所示 2-(α-D-吡喃型葡萄糖基)甲基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃 -6-醇(TMG)。\n\n〔小肠局部缺血再灌流障碍模型的病变抑制效果〕\n将大鼠腹腔动脉结扎，同时用小钳使上肠间膜动脉血流中断30分 钟，再灌流60分钟后评价小肠粘膜障碍，制成小肠局部缺血再灌流障 碍模型。如果发生小肠粘膜病变，则可确认小肠管腔内出血、蛋白漏 出、或粘膜中硫巴比妥酸(TBA)反应物质(脂质过氧化指标)增加。 以这些物质为指标，用同一模型，考察苯并二氢吡喃醇配糖体对局部 缺血再灌流障碍病变的控制效果。\nSD品系雄性大鼠(体重180～200g)1组6只，禁食18小时后使 用。在乌拉坦(1000mg/kg)麻醉下，从正中开腹，将腹腔动脉结扎后 用小钳使上肠间膜动脉根部的血流中断，制造局部缺血状态。30分钟 后，TMG以0.8mg/ml的浓度完全溶解于生理食盐水中并经调整的TMG 制剂以4mg/kg体重的剂量经静脉注射给药，然后取下钳子，使血液重 新流通。再灌流60分钟后从大动脉放血宰杀，取出小肠，定量小肠管 腔漏出血红蛋白、漏出蛋白以及小肠粘膜内TBA反应物质。\n这些结果，连同不进行局部缺血再灌流处理和TMG制剂给药的正 常组，以及局部缺血后再灌流前以等量生理食盐水代替TMG制剂进行 静脉注射给药的对照组的结果一起列于表1中。要说明的是，上述评 价项目是按以下方法测定的。\n(1)小肠管腔漏出红血球和漏出蛋白测定法\n作为局部缺血再灌流小肠粘膜障碍的指标，测定了小肠管腔内的 漏出红血球和漏出蛋白。截取从离回肠末端5cm的部位起在口侧方向 上30cm长的一段小肠，用冷生理食盐水10ml从口侧洗涤小肠管腔内， 回收的洗涤液用于测定。漏出红血球按照氰化正铁血红蛋白法(Cannan， R.K.：Am.J.Clin.Path.，44，207-210，1965)，用血红蛋白测定用 试剂盒(Hemoglobin-Testworker，和光纯药工业株式会社制)测定。 即，在发色试剂5ml(0.78mM氰化钾+0.61mM高铁氰化钾)中混合 肠管洗涤液0.2ml后在室温静置5分钟，用分光光度计(JASCO Ubest -30，UV/VIS Spectrophotometer，JASCO Engineering公司制)测定 波长540nm的吸光度。从事先用氰化正铁血红蛋白标准液(血红蛋白 18g/dl+3.1mM氰化钾+0.61mM高铁氰化钾)得到的校正曲线算出洗 涤液中的血红蛋白量，表达为小肠每单位长度的血红蛋白量。而漏出 蛋白是按照Lowry法(Lowry，O.H.：J.Biol.Chem.，193，265-275， 1951)，用蛋白定量试剂盒(Sigma化学公司制)测定的。\n(2)小肠粘膜内TBA反应物质测定法\n用Ohkawa法测定(Ohkawa，H.：Anal.Biochem.，95，351-358， 1979)。从离回肠末端5cm的部位起截取口侧方向上10cm长的一段 小肠，在长轴方向上切开后借助于2枚载玻片剥离粘膜。用10mM磷 酸缓冲液-30mM氯化钾溶液以10倍(重量％)稀释匀浆(Pyrex 10ml 匀浆器用玻璃，Digital Homogenizer 1000rpm，井内盛荣堂株式会 社)，向其中的0.2ml中添加蒸馏水0.6ml和8.1％硫酸氢钠0.2ml，再 添加pH 3.5的20％磷酸缓冲液1.5ml、0.8％TBA 1.5ml和1％BHT 40μl，用油浴(OH-50P，Taitech公司制)在95℃加热1小时后冷却 10分钟。进而，添加蒸馏水1.0ml和丁醇-吡啶(丁醇∶吡啶＝15∶1， 体积比)5.0ml、搅拌，在室温离心分离后(1500g，10分钟)得到的 上清液用分光光度计(JASCO Ubest-30，UV/VIS Spectrophotometer， JASCO Engineering公司制)测定波长535nm的吸光度。小肠粘膜匀 浆0.2ml和蒸馏水0.6ml代之以0.8ml蒸馏水作为空白，以蒸馏水0.3ml 和TEP 0.5ml作为标准，从两者得到校准曲线，测定试样的TBA反 应物质。\n                    表1 \n\n结果为平均值±标准误差。\n显著性检定是通过进行一元分散分析，在显著的情况下再做Scheffe 多重检定来进行的。\n*相对于对照组而言是显著的(P＜0.05)\n**相对于对照组而言是显著的(P＜0.01)\n从表1中可以清楚地看出，在局部缺血再灌流障碍模型(对照组) 中，可以确认小肠管腔内出血、蛋白漏出和粘膜中TBA反应物质增加， 但在TMG制剂给药组中这些指标受到显著抑制，表明本发明的局部缺 血再灌流障碍预防和治疗剂显著抑制了局部缺血再灌流引起的小肠粘 膜障碍。\n〔脑局部缺血再灌流障碍模型的病变抑制效果〕\n作为使用了大鼠的前脑局部缺血再灌流模型，使用的是4血管闭 塞模型(脑神经，47卷，369-375页，1995年)，通过5分钟脑缺血 后进行120分钟再灌流，制作了脑局部缺血再灌流障碍模型。局部缺 血再灌流的结果，可以确认引起了脑实质的细胞内和细胞外腔、有时 两者中都有异常的水分贮留、增加，从而发生病态的脑浮肿。以脑浮 肿为指标、用同样的模型，考察苯并二氢吡喃醇配糖体对脑局部缺血 再灌流障碍的病变抑制效果。\nWistar品系雄性大鼠(体重250～300g)1组6只用于实验。麻醉 是在实施椎骨动脉闭塞时经腹腔内给药泡水三氯乙醛(360mg/kg)。 实验中大鼠的体温用暖垫、暧棉卷使直肠温度维持37℃的。\n使大鼠呈腹卧姿态，将头部固定在大鼠固定器上，从后颈部正中 切开约2cm。此时用显微镜(Nagashima医学仪器公司，日本)，剥离 第2颈椎部位两侧后头直肌，确认左右椎骨动脉，并分别与结缔组织 剥离、露出。使用显微外科用双极凝固器(bipolar coagulator)，选 择性地在第2颈椎部位使左右颈椎动脉分别电凝固。进而，用显微外 科用剪刀切断凝固部位，使切断面电凝固，从而使椎骨动脉确实闭塞。 用丝线缝合皮肤，结束椎骨动脉处理。然后，使大鼠呈背卧姿态，在 前颈部正中纵切开约2cm后，在同样的显微镜下剥离、露出两侧总颈 动脉，把丝线收纳在左右总颈动脉的缺口创部中，用外科纤维(staple) 封闭创部。手术次日，拆除前颈创部的外科纤维(staple)，轻轻提起 收纳的丝线，在总颈动脉上用Sugita的脑动脉瘤用夹子(52号)使两 侧总颈动脉左右分别闭塞，制成4血管闭塞模型。\n两侧总颈动脉闭塞时间为5分钟，使前脑缺血，临再灌流前静脉 注射TMG以1.5mg/ml浓度完全溶解在生理食盐水中配制的TMG制剂 4mg/kg体重，取下总颈动脉的夹子进行再灌流。再灌流120分钟后立 即断头，迅速采集两侧大脑半球，测定湿重量。然后测定在干燥器中 以100℃、干燥48小时的脑重量，求出与干燥前的重量差为水分重。 然后，求出相对于干燥前脑重量而言的水分量之比(脑含水比例)。\n此结果，连同缺血后临再灌流前以等量生理食盐水代替TMG制剂 经静脉注射给药的对照组的结果一起，列于表2中。\n              表2     脑含水比例(％)     对照组     78.66±0.51     TMG给药组     (4mg/kg体重)     78.05±0.28*\n结果为平均值±标准偏差\n显著性检定是通过Student t-检定进行的。\n*相对于对照组而言是显著的(P＜0.05)\n从表2可以清楚地看到，TMG给药组的脑含水比例受到显著抑制。\n急性毒性试验\n对本发明的血管障碍性脑浮肿预防和治疗剂进行急性毒性试验， 以确认其安全性。用4～5周龄ICR品系小鼠1组3只，把作为苯并二 氢吡喃醇配糖体的、与上述相同的TMG悬浮于5％阿拉伯胶液中之后， 以TMG计500mg/kg经口给药1周、观察。此时，作为对照组，经口 给药0.3ml 5％阿拉伯胶液。其结果，任何一个给药组中均未发现小 鼠死亡例。\n制剂例\n〔制剂例1〕\nTMG 100g、乳糖800g和玉米淀粉100g用掺合机混合，得到散剂。\n〔制剂例2〕\nTMG 100g、乳糖450g和低取代度羟丙基纤维素100g混合后，加 10％羟丙基纤维素水溶液混炼。将此物挤出、用造粒机造粒、干燥， 得到颗粒剂。\n〔制剂例3〕\nTMG 100g、乳糖550g、玉米淀粉215g、结晶纤维素130g和硬脂 酸镁5g用掺合机混合后，用压片机压片，得到片剂。\n〔制剂例4〕\nTMG 10g、乳糖110g、玉米淀粉58g和硬脂酸镁2g用V型混合 机混合后，填充到3号胶囊中，每个180mg，得到胶囊剂。\n〔制剂例5〕\nTMG 200mg和葡萄糖100mg溶解在精制水2ml中后过滤，滤液 分装到2ml安瓿中，密封后灭菌，得到注射剂。\n产业上利用的可能性\n如上所述，本发明的局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂以苯并二 氢吡喃醇配糖体为有效成分，因而能增强生物体内的抗氧化防御体系， 从而可以有效地抑制、调节局部缺血再灌流障碍患部中的活性氧和自 由基，显著抑制局部缺血再灌流障碍的病变，和大幅度改善病态。\n此外，本发明是以具有高水溶性的苯并二氢吡喃醇配糖体为有效 成分的，因而，除作为固形制剂使用外，还可以制成含有高浓度有效 成分的水基制剂，少用量就能有效地作用于患部，从而可以预防、治 疗局部缺血再灌流障碍，同时不伴随副作用，可以极安全地使用。\n本发明的局部缺血再灌流障碍预防和治疗剂，可以用于预防和治 疗由局部缺血再灌流引起的心脏、胃、小肠、肝脏、胰脏、肾脏、脑、 眼球、皮肤等各部位的障碍，或脏器移植等中的障碍等。