检测苏丹红药物的酶联免疫试剂盒及方法

1. 一种检测苏丹红药物的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有： (1)包被有苏丹红抗原、抗体或抗抗体的酶标板； (2)酶标记物； (3)苏丹红标准品溶液； (4)底物显色液； (5)终止液； (6)浓缩洗涤液； (7)浓缩复溶液； (8)苏丹红特异性抗体浓缩液； (9)浓缩抗体稀释液， 当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有(8)和(9)，其中所用包被缓冲液为pH值为6.60.01～0.03mol/L的柠檬酸缓冲液，所用的封闭液为含有0.5％马血清、1‰叠氮化钠和3％酪蛋白的溶液。
2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：酶标记物为酶标 记抗原、酶标记抗体或酶标记抗抗体。
3、如权利要求l或2所述的试剂盒，其特征在于：酶标板中 包被的包被原为苏丹红半抗原与载体蛋白的偶联物、苏丹红特异性抗 体或抗抗体；所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋 白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白；苏丹红特 异性抗体为苏丹红单克隆抗体或多克隆抗体；所述苏丹红单克隆抗体 为抗苏丹红的单克隆杂交瘤细胞株B-l-l CGMCC No. 1706分泌的单 克隆抗体；抗抗体为山羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
4、如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：酶标记物为 酶标记抗抗体、酶标记苏丹红半抗原或酶标记特异性抗体；其中抗抗 体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；标记酶为辣根过氧化物酶或细菌权利要求书第2/2页提取碱性磷酸酯酶。
5、 如权利要求l或2所述的试剂盒，其特征在于，标记酶为辣 根过氧化物酶，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲、底物显色 液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺、终止液为1 ~ 2mol/L的硫酸或盐 酸缓冲液。
6、 如权利要求l或2所述的试剂盒，其特征在于，标记酶为细 菌提取碱性磷酸酯酶，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为 2mol/L的氢氧化钠。
7、 如权利要求l或2所述的试剂盒，其特征在于，浓缩洗涤液 为0.01M ， pH7.4，含有0.8% ~1.2%吐温20和0.5%叠氮化钠防腐 剂的磷酸盐缓冲液；浓缩复溶液为2x的0.04mol/L的磷酸盐缓冲液； 封闭液含有3-10%的牛血清，2%酪蛋白的磷酸盐缓冲液。
8、 如权利要求l或2所述的试剂盒，其特征在于：苏丹红标准 品溶液的浓度分别为（Hig/L， 0.1pg/L， 0.4]ig/L， 1.6pg/L， 6.4ng/L， 25如g/L。
9、 一种检测样品苏丹红药物残留的方法，包括步骤：(1) 样品前处理；(2) 用任一权利要求1-8所述的试剂盒进行检测；(3) 分析检测结果。

检測苏丹红药物的酶联免疫试剂盒及方法技术领域本发明涉及一种检测辣椒酱、辣椒油、辣椒粉食品中苏丹红药物的酶联免 疫试剂盒及方法。背条资料苏丹红（Sudani)是一种人工合成的红色染料，常作为一种工业染料，被 广泛用于如溶剂、油、蜡、汽油的增色以及鞋、地板等增光方面。苏丹一号染 色剂含有"偶氮苯"，当"偶氮苯"被降解后，就会产生"苯胺"，这是一种中 等毒性的致癌物。过量的"苯胺"被吸入人体，可能会造成组织缺氧，呼吸不 畅，引起中枢神经系统、心血管系统和其他脏器受损，甚至导致不孕症，因其 严重的致癌性、致敏性和遗传毒性我国及欧盟等国已明文规定禁止其作为色素 在食品中进行添加，2005年2月18日，英国食品标准局(TheFoodStandardAgency， FSA)就含有添加苏丹红色素的食品向消费者发出警告，并在其网站上公布了 可能含有苏丹红I的产品清单。检测苏丹红残留量的化学方法目前有高效液相色谱法，由于复杂的仪器设 备和繁瑣的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。发明内容(一） 要解决的技术问题本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控 且适合大量样本筛查的方法用于检测辣椒酱、辣椒油、辣椒粉食品中苏丹红染 料的残留量。(二） 技术方案本发明的检测原理为：当在微孔条上预包被苏丹红偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入苏丹红特异性抗体溶液，样本中残留的苏丹红或苏丹红标准品与酶标板 上包被的苏丹红偶联抗原竟争苏丹红特异性抗体,加入酶标记抗抗体进行放大 作用，用显色液显色，样本吸光值与样本中苏丹红的含量成负相关，与标准曲 线比较即可得出样本中苏丹红的残留量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅， 与系列浓度苏丹红标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中苏丹红残留量的 浓度范围。当在微孔条上预包被苏丹红特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液 后，再加入酶标记苏丹红半抗原溶液，样本中残留的苏丹红或苏丹红标准品与 酵标记抗原竟争包被在酶标板上的苏丹红特异性抗体，用显色液显色，样本吸 光值与苏丹红药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中苏丹红的 残留量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度的苏丹红标准品溶液 颜色的比较可粗略判断样品中苏丹红残留量的浓度范围。当在微孔条上预包被苏丹红偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后， 再加入酶标记苏丹红特异性抗体溶液，样本中残留的苏丹红或苏丹红标准品与酶标板上包被的苏丹红抗原竟争苏丹红特异性抗体，用显色液显色，样本吸光 值与样本中苏丹红的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中苏丹红的残留量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度苏丹红标准品溶液颜 色的比较可粗略判断样品中苏丹红残留量的浓度范围。当在微孔条上预包被抗抗体时，加入苏丹红抗体孵育后，加入样本溶液或 标准品溶液，再加入酶标记苏丹红半抗原溶液，样本中残留的苏丹红或苏丹红 标准品与酶标记苏丹红半抗原竟争苏丹红特异性抗体，用显色液显色，样本吸 光度值与样本中苏丹红的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中苏丹 红的残留量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度苏丹红标准品溶 液颜色的比较可粗略判断样品中苏丹红残留量的浓度范围。本发明提供了一种用于检测苏丹红物的酶联免疫试剂盒，它含有： (1)包被有包被原的酶标板（包被原为抗原、抗体或抗抗体）；(2) 酶标记物（为酶标记抗原、酶标记抗体或酶标记抗抗体）；(3) 苏丹红特异性抗体浓缩液（当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标 记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有）;(4) 苏丹红标准品溶液；(5) 底物显色液；(6) 终止液；(7) 浓缩洗涤液；(8) 浓缩抗体稀释液（当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体 或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有）。(9) 浓缩复溶液。本发明所提供的检测苏丹红的酶联免疫试剂盒,包括包被有包被原的酶标 板、可能含有苏丹红特异性抗体浓缩液（酶标板上包被抗原，酶标记物为酶标 记抗抗体时或酶标板上包被的抗抗体，酶标记物为酶标记抗原）和酶标记物工 作液；所述包被原可为苏丹红偶联抗原、苏丹红特异性抗体或抗抗体；所述酶 标记物为酶标记的抗抗体、苏丹红半抗原或苏丹红特异性抗体；所述抗抗体为 羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。所述苏丹红半抗原是将苏丹红和琥珀酸酐通过酰化反应得到的。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根 过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体是釆用戊二醛法或过碘酸 钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的，辣根过氧化物酶可采用现有技术中的 多种方法将其与抗抗体进行偶联，如戊二醛法，过碘酸钠法等，本发明经过长 期的劳动创造将过碘酸钠法进行了改良，使其省时、降低辣根过氧化物酶 (HRP)与抗抗体的浓度比率，节省了原材料。所述苏丹红特异性抗体可为苏丹红单克隆抗体或苏丹红多克隆抗体；它们 均是用苏丹红半抗原与载体蛋白采用混合酸酑法得到的偶联物作为免疫原得 到的；所述苏丹红多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述苏丹红单克隆抗体优选为苏丹红鼠单克隆抗体，所述苏丹红多克隆抗体优选 为苏丹红兔多克隆抗体。所述苏丹红单克隆抗体优选为抗苏丹红的单克隆杂交瘤细胞株B-l-l CGMCC No. 1706分泌的单克隆抗体。所述抗苏丹红的单克隆杂交瘤细胞株B-l-l CGMCC No. 1706已于2006 年4月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC )。以上抗体均可以用苏丹红半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原按混合 酸酐法制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白（BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白等常用载体蛋白；所述苏丹红半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将苏丹红半抗原和载体蛋白用混 合酸酐法进行偶联得到。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括苏丹红标准品溶 液、底物显色液、终止液、浓縮洗涤液、浓缩抗体稀释液（酶标板上包被抗原， 酶标记物为酶标记抗抗体时或酶标板上包被的抗抗体，酶标记物为酶标记抗原），浓缩复溶液为2x的0.04mol/L的磷酸盐缓冲液。所述浓缩洗涤液为0.01M , pH7.4，含有0.8% ~1.2%吐温20和0.5%叠 氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。所述浓缩复溶液为2x的0.04mol/L的磷酸盐缓冲液。所述当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液由显色液A液和显色液B 液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或 四甲基联苯胺，终止液为1 ~2mol/L硫酸；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色 液为对硝基苯磷酸酯缓冲液，终止液为1-2mol/L氢氧化钠溶液。当酶标板上包被抗原，酶标记物为酶标记抗抗体时或酶标板上包被的抗抗 体，酶标记物为酶标记抗原时所述浓缩抗体稀释液为pH8.6， 0.05mol/L含有2 %小牛血清、10%甲醇的磷酸盐缓冲液。其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH 6.6 0.01 ~ 0.03mol/L 的柠檬酸钠缓冲液；所用的封闭液含有0.5%马血清，1%。叠氮化钠，3%酪蛋 白的磷酸盐缓冲液。本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成 0.05-O.lpg/ml,每孔加入IOOm!， 37C温育2h，再4t:过夜，倾去包被液，用的清洗剂。但是，仅仅证实，该剥离组合物成功地清洗了来自包括单一金属层（当金属结构主要包括Al—Si或Al—Si—Cu时）在内的简单 微电路制造中的接触孔和金属线蚀刻的"侧壁聚合物"和含有仅一种 有机金属化合物与铝的残留物。4. 美国专利No. 4，617，251教导了一种正型光致抗蚀剂剥离组合 物，其含有（A)选择的胺化合物（例如，2-(2-氨基乙氧基)-乙醇）； 2-(2-氨基乙氨萄-乙醇；或其混合物）和（B)选择的极性溶剂（例如， N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢化呋喃醇、异佛尔酮、二甲亚砜、己二酸二 甲酯、戊二酸二甲酯、环丁砜、Y-丁内酯、N，N-二甲基乙酰胺或其混 合物）。此参考文献进一步教导了可以向组合物中加入水与染料或色 料、湿润剂、表面活性剂和消泡剂。5. 美国专利No. 4，770，713教导了一种正型光致抗蚀剂剥离组合 物，其含有（A)选择的酰胺（例如，N，N-二甲基乙酰胺；N-甲基乙酰 胺；N,N-二乙基乙酰胺；N，N-二丙基乙酰胺；N，N-二甲基丙酰胺；N，N-二乙基丁酰胺或N-甲基-N-乙基丙酰胺）和（B)选择的胺化合物（例 如，单乙醇胺、单丙醇胺、或甲氨基乙醇）。该专利还教导了这种剥离 剂可以任选含有一种水性可混溶的非离子洗涤剂（例如，烯化氧縮和 物、酰胺或半极性非离子化合物）。6. 美国专利No. 4，824，763教导了一种正型功致(positive-wording) 光致抗蚀剂剥离组合物，其含有（A)三胺（例如，二亚乙基三胺）和(B)极性溶剂（例如，N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、丁内酯、 脂族烃、芳香烃、或氯化烃)。7. 美国专利No. 4,904,571教导了印刷电路板光致抗蚀剂剥离剂组 合物，其含有（A)溶剂（例如，水、醇、醚、酮、氯化烃或芳香烃）;(B)溶解在上述溶剂中的碱性化合物（例如，伯胺、仲胺、叔胺、环 胺、聚胺、季铵类胺、氢氧化锍、碱性氢氧化物、碱性碳酸盐、碱性 磷酸盐或碱性焦磷酸盐）；和（C)溶解在上述溶剂中的氢硼化物（例 如，氢硼化钠、氢硼化锂、二甲胺硼垸、三甲基硼烷、pyridaneborone、 叔丁胺硼烷、三乙基胺硼烷或吗啉硼烷)。8. 美国专利No. 5,102,777教导了一种正型光致抗蚀剂剥离剂组合 物，其包含（A) —种溶剂（例如，吡咯垸酮化合物、二甘醇一烷基醚、(1) 样品前处理；(2) 用试剂盒进行检测；(3) 分析检测结果。本发明提供以苏丹红为食品添加剂食品的样本(水基质、油基质及粉末状） 处理，称取样本于离心管中，加入乙腈震荡离心进行提取，移取上清液氮气吹 干，加入正己烷进行萃取，强碱去杂质，取上层氮气吹干，用于检测。本发明中用试剂盒检测是：当包被原为苏丹红偶联抗原时，向酶标板微孔 中加入标准品溶液或样本溶液再加入抗体，温育后洗涤拍干，再加入酶标抗抗 体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为苏丹 红偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记抗 体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为苏丹 红特异性抗体时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记苏 丹红半抗原，温育后洗涤拍千，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被 原为抗抗体时，向酶标板微孔中加入苏丹红抗体，温育后洗涤拍干，再加入标 准品溶液或样品溶液后加入酶标苏丹红半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止， 用酶标仪测定吸光度值。本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光 度平均值（B)除以第一个标准溶液（O标准）的吸光度值（Bo)再乘以IOO %,即百分吸光度值。计算公式为：百分吸光度值（％) = (B/Bq) x 100 %以苏丹红标准品溶液的浓度（[ig/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值 为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相 对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中苏丹红的残留量。本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。 本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样 品的快速分析，整个检测过程只需1.5小时可以完成，样本最低检测限为8pg/L (kg)。(三）有益效果本发明中检测食品中苏丹红的酶联免疫试剂盒主要采用间接竟争ELISA 方法定性或定量检测辣椒酱、辣椒油、辣椒粉等食品中苏丹红染料的残留量， 样品前处理过程简单，能同时检测大批样品。本发明釆用髙特异性的苏丹红单克隆抗体或多克隆抗体，主要试剂以工作 液形式提供，检验方法简便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度髙等特点， 将在食品中苏丹红的残留检测中发挥重要作用。附图说明图l:苏丹红的检测标准曲线图。 具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明，而不用来限制本发明的范围。 实施例l试剂盒组分的制备1.抗原的合成a. 半抗原的合成将苏丹红用琥珀酸酐法合成苏丹红半抗原。具体步骤：取苏丹红5g溶于 20mlDMF中加入琥珀酸酐3g及50ml吡嗖80'C回流反应70 ~ 80小时，抽干 除去溶剂用纯水洗涤5次（30ml/次）烘干即可。b. 免疫原合成将苏丹红半抗原和卵清蛋白，采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原。 免疫原的制备过程：取苏丹红半抗原2g溶于30ml， 50%的N，N-二甲基甲 酰胺溶液中，再取0.51111氯甲酸异丁酯溶于5ml无水二噁烷中，加到半抗原溶 液中室温搅拌反应4小时，取载体蛋白32g溶于70mlpH9.6碳酸盐缓冲液中， 再将入人血清白蛋白滴加到半抗原中4'C搅拌过夜。将反应完的人工抗原用 透析袋装好放入0.2M的磷酸盐缓冲液中透析7天，每天换液3~4次。最后 将抗原冻干保存。c. 包被原苏丹红偶联抗原的制备将苏丹红半抗原和甲状腺蛋白，采用混合酸酐法进行偶联得到包被抗原。包被原的制备过程：取苏丹红半抗原2g溶于30rnl， 50%的N，N-二甲基甲 酰胺溶液中，再取0.51111氯甲酸异丁酯溶于5ml无水二噁烷中，加到半抗原溶 液中室温搅拌反应4小时，取载体蛋白32g溶于70mlpH9.6碳酸盐缓冲液中， 再将卵清蛋白滴加到半抗原中4'C搅拌过夜。将反应完的人工抗原用透析袋 装好放入0.214的磷酸盐缓冲液中透析7天，每天换液3~4次。最后将抗原 冻干保存。2. 单克隆抗体的制备a. 动物免疫将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为80ng/只，使其产生多克隆 抗体。b. 细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5 : 1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，釆用 间接竟争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进 行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株-苏丹红的单克隆杂 交瘤细胞株B-l-l CGMCC No. 1706。c. 细胞冻存和复苏将苏丹红的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1 x 106个/1111的细胞悬液， 在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37匸水浴中速融，离心去 除冻存液后，移入培养瓶内培养。d. 单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4ml/只，7天后腹腔注射苏丹红的单 克隆杂交瘤细胞株5xl()S个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行 纯化，纯化后的腹水放入-20'C环境保存。3. 多克隆抗体的制备釆用新西兰大白兔作为免疫动物，以苏丹红半抗原与卵清蛋白偶联物为免 疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐混合制成乳 化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3〜4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次 免疫10天后釆血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯 化的多克隆抗体。4. 羊抗鼠抗抗体的制备过程：以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫 原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；羊抗兔抗抗体的制备：以山 羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔 抗抗体。5. 酶标板的制备用包被缓冲液将苏丹红偶联抗原、抗体或抗抗体稀释成0.05-0.1^1111，每 孔加入100^1， 37'C温育2h或4'C过夜，倾去包被液，用稀释20倍的浓缩洗涤液 洗涤2次，每次30秒，拍千，然后在每孔中加入15(Hil封闭液，37。C温育2h，倾 去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。 实施例2检测苏丹红的酶联免疫试剂盒的组建组建检测苏丹红的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：(1) 包被苏丹红偶联抗原的酶标板；(2) 用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；(3) 苏丹红单抗体浓缩液；(4) 苏丹红标准品溶液6瓶，浓度分别为0(ig/L, 0.1jig/L， 0.4ng/L, 1.6jig/L， 6.4ng/L， 25.6|Ag/L;(5) 底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显 色液B液为四甲基联苯胺；(6) 终止液为2mol/L盐酸；(7) 浓缩洗涤液为0.01M , pH 7.4,含有0.8% ~ 1.2%吐温20和0.5%叠 氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液；(8) 抗体稀释液为pH8.6， 0.05mol/L含有2。/。小牛血清、10%甲醇的磷酸盐缓冲液。(9)浓缩复溶液为2x的0.04mol/L的磷酸盐缓冲液。 实施例3样品中苏丹红残留的检测1. 样品前处理以苏丹红为食品添加剂食品的样本（水基质、油基质及粉末状）处理步骤 称取2g样本于离心管中，加入10ml乙腈，剧烈震荡10min，室温3000rpm 以上离心10min。移取5ml上清液于50。C环境下氮气吹干。加入4ml正己烷 涡动30s溶解干燥的残留物，加入lml 1MNaOH涡动15s室温3000rpm离心 10min，移取lml上清液于50'C环境下氮气吹干，加入0.5ml DMF充分溶解干 燥的残留物，取50^加入950^il稀释好的复溶液充分混匀，得到待测样品溶 液。2. 用试剂盒检测向苏丹红偶联抗原包被的酶标板微孔中加入苏丹红标准品溶液或样本溶 液50jil，再加入苏丹红单克隆抗体工作液50ja1，用盖板膜封板，37"C恒温箱 中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250nl洗涤液，30秒后倒出孔中液体， 如此重复搡作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 抗抗体工作液l(KHil, 37"C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步 骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胸TMB), 轻轻振荡混句，37X:恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液盐酸 50^U,轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。3. 检测结果分析用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值（B)除以第一个标准 品溶液（0标准）的吸光度值（Bo)再乘以10(r/。，得到百分吸光度值。以苏丹 红标准品浓度（pg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲 线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出样本中苏丹红的残留量。 实验例l标准品精密度试验：分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出 一批酶标板，每批各抽取 IO个试剂盒，每板备抽出20个微孔，测定4.5ng/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。表l标准可重复性试验（CV%)table see original document page 14\n通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各测定10次标准品变异系数在 3.8%~11.7%之间，符合精密度小于或等于20%的规定。实验例2样本精密度和准确度试验a.样品精密度试验：取苏丹红标样，添加15ng/L到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各三 个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表。表2水基质添加染料样品可重复性试验table see original document page 14\n15.4 12.6 9.4 13.6 10.8 19.0表3油基质添加染料样品可重复性试验批号 实测值（[ig/kg)CV% 11.7 10.4 8.9 10.2 15.7 18.70506008 16.2 14.7 9.5 13.7 15.2 17.5 14.7 10.6 12.5 9.7 10.4 17.9 9.7 10.2 13.5 8.5 11.6 13.70507003 8.7 10.0 12.6 11.4 10.7 14.2 11.6 13.7 14.6 15.2 10.9 23 12.7 9.5 10.2 16.7 13.8 11.60507009 15.7 11.6 13.4 14.2 12.6 15.8 13.7 16.4 15.4 12.9 10.8 18.7表4粉末状添加染料样品可重复性试验 批号 实测值（[ig/kg) 变异系数cv免 10.7 14.2 16.8 10.5 10.2 23.30506008 13.6 10.7 12.8 8.7 9.4 19.2 10.7 16.4 13.8 14.2 10.6 18.9 8.4 9.2 11.6 13.4 14.5 23.00507003 13.7 11.6 12.8 10.4 9.5 14.7 10.7 8.4 12.6 9.8 8.6 17.1 11.6 12.4 10.8 9.5 11.7 9.90507009 10.7 9.3 12.2 9.5 8.0 15.9 12.4 11.6 13.8 10.6 8.7 16.8结果表明，水基质添加染料样品变异系数均低于25%，油基质添加染料样品的变异系数均低于25% ，粉末状添加染料样品的变异系数均低于25% 。 b.样本准确度试验取三个浓度的苏丹红标准品溶液分别为10fig/kg (L)、 5(Hig/kg (L)和100[ig/kg (L)，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，具体方 法如实施例l中样品前处理步骤，分别计算准确度。表5试剂盒的准确度样本 水基质 油基质 添加染料样品 添加染料样品 添加浓度 (jig/kg) 10 50 100 10 50 100 1 63.7 83.4 83.4 68.5 78.4 94.8准确度 2 71.6 74.6 102.3 73.6 92.0 82.7 3 69.5 86.5 87.4 64.7 84.7 79.4 4 60.8 82.4 93.5 63.5 72.6 83.5平均值％ 66.4 81.7 91.7 67.6 81.9 85.1样本 粉末状添加染料样品 添加浓度 (|Ag/kg) 10 50 100 1 67.4 72.4 84.7准确度 2 73.5 76.4 72.4% 3 74.9 81.4 92.6 4 62.8 87.6 87.4平均值％ 69.7 79.5 84.3结果表明水基质添加染料样品添加准确度在60.8%-1023%之间，油基质添 加染料样品添加准确度在63.5%-94.8%之间，粉末状添加染料样品添加准确度 在62.8%-92.6%之间。实验例3交叉反应率试验：选择与苏丹红有类似结构和类似功能的2种药物测定交叉反应率。通各种药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交 叉反应率。交叉反应越大，那么此试剂盒对苏丹红的检测的特异性就越好。交叉反应率（％)=(引起50%抑制苏丹红的浓度/引起50%抑制的类似物浓度）x 100%表6试剂盒的特异性table see original document page 17\n试剂盒保存条件为2-8'C，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值（零 标准）、50%抑制浓度、苏丹红添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运 输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37'C保存的条件下 放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考 虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20'C冰箱冷冻5天，测定结果也表 明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8°。至少可以 保存6个月以上

序号	公开(公告)号	公开(公告)日	申请日	专利名称	申请人
1	EP0982590A1	暂无	1999-07-01	Labeled conjugate and detection method using the same有效专利	NITTO DENKO CORPORATION
2	JP2000055919A	暂无	1998-08-03	METHOD AND REAGENT FOR INSPECTING SUBSTANCE TO BE INSPECTED失效专利	NITTO DENKO CORP
3	CN1030300A	1989-01-11	1988-06-13	利用酶标免疫检测法同时测定人体中的抗原和/或抗体失效专利	科特公司
4	CN1037969A	1989-12-13	1989-01-31	通过免疫测定法检测化学物质失效专利	国际壳牌研究有限公司
5	DE10252806A1	暂无	2002-11-13	未知	DEVELOGEN AG

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