一种小叶杨与胡杨杂交种再生苗的培育方法

1.一种小叶杨与胡杨杂交种再生苗的培育方法，其特征在于：包括以下步骤，S1、建立外植体灭菌及无菌体系：于4～5月份，在室外生长的小与胡杨植株上剪取长20～30cm的当年生枝条，用软毛刷蘸取已加入清洗剂的自来水清洗外植体枝条表面的污渍及灰尘，之后用玻璃棒蘸取一滴吐温80对枝条进行深层清洗，清洗后将外植体枝条置于流水下冲洗4～6个小时，之后置于超净工作台上进行灭菌处理；
S2、不定芽诱导与增殖：
A)、将完成灭菌处理的外植体材料放置在经过高压灭菌处理并铺有双层滤纸的培养皿中，剪除前后两端切口，保留茎段与叶片部分，茎段剪至长0.5cm长的小段，叶片剪至0.5cm×0.5cm的小片，并将四周边缘部分剪除，之后平铺接种至不定芽诱导培养基表面，用镊子轻轻按压使叶片与茎段的切口部分分别与培养基充分接触，最后进行封口培养；
B)、培养条件：接种后首先在暗环境中培养3天，之后置于温度24±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间14h/d的环境中培养；
S3、生根培养：
A)、选取步骤S2培养30天～40天、生长健壮、高2～3cm的小与胡杨不定芽为试验材料，剪取不定芽接种于盛有生根培养基的瓶中进行封口培养试管苗；
B)、培养条件：培养室温度设置为25℃，先暗培养4天，4天后逐渐增强光照强度且光照时间为12h/d，培养40天～50天后光照强度控制在1800～2200lx且光照时间为12h/d；
S4、炼苗移栽：选择经过40天～50天生根培养、根系发达、生长健壮的试管苗，先将瓶盖打开1/2后注入100ml蒸馏水，室内自然光下放置3天后将瓶盖全部打开，添加50ml蒸馏水，继续置于室内自然光下放置2天，随后将瓶苗移至温室全部打开瓶盖后放置2天后，用清水清洗瓶苗根部的培养基，清洗干净后移栽至蛭石、锯末、泥炭土的混合基质中，移栽完成后放置在苗床上，苗床上部覆盖规格为50％～70％的双层遮荫网，避免阳光直射，每天傍晚进行喷灌浇水，保证营养钵内土壤湿度为60％～80％，试管苗移栽定植15天后，根据土壤干湿情况适当增减浇水量，温室条件下生长30天后即可进行露地移栽定植
步骤S2中的诱导培养基配方为改良WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+KT0.1mg/L+活性炭
3.0g/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L，诱导培养基Ph6.0。
2.根据权利要求1所述的小叶杨与胡杨杂交种再生苗的培育方法，其特征在于：步骤S1中灭菌处理具体操作步骤如下，首先采用75％的乙醇对外植体枝条灭菌10s～30s，之后用无菌水冲洗3～5次；第二步用浓度为0.1％的HgC12消毒3～5min，之后用无菌水冲洗5～7次，最后用经过高压灭菌的滤纸吸干外植体表面残留的水分后接种。
3.杂交种再生苗的培育方法，其特征在于：根据权利要求1所述的小叶杨与胡杨杂交种再生苗的培育方法，其特征在于：步骤S3中的生根培养基配方为1/2WPM+蛋白胨1g/L+IBA0.4mg/L+香蕉150g/L+活性炭3.0g/L琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L。
4.根据权利要求1所述的小叶杨与胡杨杂交种再生苗的培育方法，其特征在于：步骤S4中蛭石、锯末、泥炭土三种基质的体积比例为2：1：1。

一种小叶杨与胡杨杂交种再生苗的培育方法\n技术领域：\n[0001] 本发明属于植物再生苗培育技术领域，尤其是涉及一种小叶杨与胡杨杂交种再生苗的培育方法。\n背景技术：\n[0002] 我国西北有大面积荒漠化及盐渍化土地分布，这些土地的改良及利用是我国生态环境建设及林业可持续发展的重要任务，而造林树种的贫乏是进行荒漠盐渍化土地改良面临的主要困难之一，为迅速有效地解决这一问题，除进行耐盐树种引种驯化外，还必须同时大力开展耐盐、耐旱品种的选育。\n[0003] 小与胡杨(Populus simonii×P.euphratica)是我国学者董天慈于1980年成功培育的一种耐干旱、盐碱而又能在较广泛生态条件下生长的杨树杂交新品种，它是以小叶杨(Populussimonii Carr.)为母本(♀)、胡杨(P.euphratica Oliv.)为父本(♂)进行多次、反复杂交试验后获得的完全具有双亲融合性状的优良品种。总体来说，小与胡杨兼有小叶杨和胡杨两者的优点，即比小叶杨更耐盐碱，比胡杨更抗干旱、而且生长迅速，因此成为干旱地区盐渍化土地改良及植树造林中很有前途的树种。\n[0004] 目前，国外有关小与胡杨的研究报道还是空白，国内学者主要在杂交育种技术、硬枝扦插繁殖及引种驯化、幼苗的抗旱性等方面开展了一些研究，而有关其组织培养快速繁殖方面至今未见报道。\n[0005] 组织培养是在植物生理学以及细胞学的基础上发展起来的无性繁殖方法。因其具有能使植物种植摆脱周期长，可集中控制，规模化、自动化生产，不受外界自然条件的影响，所繁殖的苗木可以很好地保持母株的优良性状等优点，被广泛应用于分子生物技术、苗木快速繁殖、脱毒苗生产、育种、次生代谢物生产及种质资源保存等各种领域，并产生了巨大的经济效益和生态效益。因此，利用现代生物学技术，在不改变其母株优良性状的前提下，开展小与胡杨的组织培养，可在较短时间内成功培育出优质种苗，为我国西北干旱荒漠区盐渍化土地改良及荒漠区植树造林苗木的选择提供参考。\n发明内容：\n[0006] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种在较短时间内实现了小与胡杨优质试管苗的快速繁殖且成活率高的培育方法。\n[0007] 为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种小叶杨与胡杨杂交种再生苗的培育方法，包括以下步骤，\n[0008] S1、建立外植体灭菌及无菌体系：于4～5月份，在室外生长的小与胡杨植株上剪取长20～30cm的当年生枝条，用软毛刷蘸取已加入清洗剂的自来水清洗外植体枝条表面的污渍及灰尘，之后用玻璃棒蘸取一滴吐温80对枝条进行深层清洗，清洗后将外植体枝条置于流水下冲洗4～6个小时，之后置于超净工作台上进行灭菌处理；\n[0009] S2、不定芽诱导与增殖：\n[0010] A)、将完成灭菌处理的外植体材料放置在经过高压灭菌处理并铺有双层滤纸的培养皿中，剪除前后两端切口，保留茎段与叶片部分，茎段剪至长0.5cm长的小段，叶片剪至\n0.5cm×0.5cm的小片，并将四周边缘部分剪除，之后平铺接种至不定芽诱导培养基表面，用镊子轻轻按压使叶片与茎段的切口部分分别与培养基充分接触，最后进行封口培养；\n[0011] B)、培养条件：接种后首先在暗环境中培养3天，之后置于温度24±2℃、光照强度\n1500～2000lx、光照时间14h/d的环境中培养；\n[0012] S3、生根培养：\n[0013] (1)选取步骤S2培养30天～40天、生长健壮、高2～3cm的小与胡杨不定芽为试验材料，剪取不定芽接种于盛有生根培养基的瓶中进行封口培养试管苗；\n[0014] (2)培养条件：培养室温度设置为25℃，先暗培养4天，4天后逐渐增强光照强度且光照时间为12h/d，培养40天～50天后光照强度控制在1800～2200lx且光照时间为12h/d；\n[0015] S4、炼苗移栽：选择经过40天～50天生根培养、根系发达、生长健壮的试管苗，先将瓶盖打开1/2后注入100ml蒸馏水，室内自然光下放置3天后将瓶盖全部打开，添加50ml蒸馏水，继续置于室内自然光下放置2天，随后将瓶苗移至温室全部打开瓶盖后放置2天后，用清水清洗瓶苗根部的培养基，清洗干净后移栽至蛭石、锯末、泥炭土的混合基质中，移栽完成后放置在苗床上，苗床上部覆盖规格为50％～70％的双层遮荫网，避免阳光直射，每天傍晚进行喷灌浇水，保证营养钵内土壤湿度为60％～80％，试管苗移栽定植15天后，根据土壤干湿情况适当增减浇水量，温室条件下生长30天后即可进行露地移栽定植。\n[0016] 作为优选，步骤S1中灭菌处理具体操作步骤如下，首先采用75％的乙醇对外植体枝条灭菌10s～30s，之后用无菌水冲洗3～5次；第二步用浓度为0.1％的HgC12消毒3～\n5min，之后用无菌水冲洗5～7次，最后用经过高压灭菌的滤纸吸干外植体表面残留的水分后接种。\n[0017] 作为优选，步骤S2中的诱导培养基配方为改良WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+KT0.1mg/L+活性炭3.0g/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L，诱导培养基Ph6.0。\n[0018] 作为优选，步骤S3中的生根培养基配方为1/2WPM+蛋白胨1g/L+IBA0.4mg/L+香蕉\n150g/L+活性炭3.0g/L琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L。\n[0019] 作为优选，步骤S4中蛭石、锯末、泥炭土三种基质的体积比例为2：1：1。\n[0020] 与现有技术相比，本发明的有益之处是：\n[0021] 1、本发明采用组织培养的方法，在较短时间内实现了小与胡杨优质试管苗的快速繁殖，整个繁殖过程从丛生芽诱导与增殖到试管苗生根仅需60天左右，大大提高了小与胡杨的成苗速度，对其植株的规模化、工厂化生产、扩繁具有重要作用，可为我国西北干旱荒漠区盐渍化土地改良及荒漠区植树造林源源不断地提供优质苗木；\n[0022] 2、本发明通过采用组织培养的方法对小与胡杨优质苗木的快速繁殖进行试验研究表明采用WPM培养基是最适合小与胡杨快速诱导繁殖的基本培养基配方，其中改良WPM+\n6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+KT0.1mg/L+活性炭3.0g/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L是最适宜进行不定芽诱导与增殖的培养基配方，增殖率达89.3％；\n[0023] 3、本发明通过采用组织培养的方法对小与胡杨优质苗木的快速繁殖进行试验研究1/2WPM+蛋白胨1g/L+IBA0.4mg/L+香蕉150g/L+活性炭3.0g/L琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L是最适宜小与胡杨进行生根培养的配方，生根率达96.7％；\n[0024] 4、炼苗过程中采用前3天打开1/2的瓶盖，而后逐渐完全打开的方法，最后将试管苗成功移栽至蛭石、锯末、泥炭土三种基质按照体积比例2：1：1配比的混合基质中，移栽后成活率达94.85％。\n附图说明：\n[0025] 下面结合附图对本发明进一步说明。\n[0026] 图1是本发明的培育方法步骤示意图。\n[0027] 图2是不同试剂灭菌后茎段、叶片成活率的比较图。\n[0028] 图3是不同处理条件下小与胡杨茎段诱导增殖情况图。\n[0029] 图4是不同处理条件下小与胡杨生根情况图。\n[0030] 图5是不同基质配比对小与胡杨炼苗移栽成活率的影响比较图。\n具体实施方式：\n[0031] 下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细描述：\n[0032] 如图1所示的小叶杨与胡杨杂交种再生苗的培育方法，包括，\n[0033] 1.建立无菌体系\n[0034] 1.1外植体材料的处理\n[0035] 剪取室外生长的长20～30cm的小与胡杨当年生枝条，带回实验室后用软毛刷蘸取已加入清洗剂的自来水清洗外植体枝条表面的污渍及灰尘，之后用玻璃棒蘸取一滴吐温80进行深层清洗，清洗后将外植体置于流水下冲洗4～6个小时，之后置于超净工作台上进行灭菌处理。具体灭菌时间设置及灭菌所用试如下：采用正交试验的方法安排实验内容，第一步用75％的乙醇对外植体分别灭菌10S、20S、30S，之后用无菌水冲洗3～5次；第二步用浓度为0.1％的HgCL2(氯化汞)分别消毒3min、4min、5min，之后用无菌水冲洗5～7次，最后用经过高压灭菌的滤纸吸干外植体表面残留的水分后接种。\n[0036] 1.2结果分析\n[0037] 如图2所示，采用75％的乙醇和0.1％的HgCL2不同处理时间对小与胡杨叶片和茎段进行灭菌，结果表明，茎段和叶片均在乙醇处理10s时成活率较大，茎段成活率达到最大值为乙醇10s、氯化汞4min的处理，成活率为76.95％，之后随乙醇与氯化汞处理时间的延长成活率逐渐降低；叶片最大值为乙醇10s、氯化汞3min的处理，成活率为53.31％，在此之后成活率也随乙醇和氯化汞处理时间的延长而逐渐降低，在乙醇处理30s时，叶片全部干枯死亡，说明乙醇较长时间的处理不利于对小与胡杨叶片进行灭菌。\n[0038] 2.不定芽诱导与增殖\n[0039] 2.1外植体接种\n[0040] 将完成灭菌处理的外植体茎段和叶片材料放置在经过高压灭菌处理并铺有双层滤纸的培养皿中，茎段剪除前后两端切口，剪至长0.5cm左右长的小段；叶片用滤纸吸干表面的水分后剪至0.5×0.5cm的小片，并将四周边缘部分剪除，之后将叶片、茎段两种材料分别平铺接种至不定芽诱导培养基表面，用镊子轻轻按压使叶片与茎段的切口部分分别与培养基充分接触，最后进行封口培养。\n[0041] 2.2培养条件\n[0042] 不定芽诱导培养基Ph为6.0，接种后首先在暗环境中培养3天，之后置于温度24±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间14h/d的环境中培养。\n[0043] 2.3结果与分析\n[0044] 如图3所示，进行小与胡杨不定芽诱导与增殖的培养基为WPM基本培养基，再培养基中分别加入6-BA(0.3mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)、NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L)、KT(0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L)以及活性碳(1g/L、3g/L、5g/L)，外植体茎段不定芽诱导与增殖效果如图3所示，对照采用改良后的WPM基本培养基，培养基中不加任何添加物，茎段接种后15天，外植体枯黄死亡，不发生诱导；图3中1-9处理时，外植体茎段经过诱导均能长出不定芽，但采用不同给处理时不定芽增殖率与生长状况差异较大，当培养基钟6-BA浓度为\n0.3mg/L时，不定芽诱导率随NAA、KT以及活性炭浓度的增加而逐渐增大，当6-BA浓度为\n0.5mg/L时，不定芽诱导率也随其它几种添加物浓度的增加而逐渐增大，当NAA为0.3mg/L、KT0.1为mg/L、活性炭3g/L时，茎段不定芽诱导率达到最大值89.30％，此时不定芽诱导速度快、增殖率率高、芽苗长势良好；当培养基中6-BA浓度增加为1.0mg/L时，诱导增殖率逐渐降低，且诱导出的不定芽多产生畸形；因此最适宜小与胡杨进行不定诱导与增殖培养的培养基配方为改良WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+KT0.1mg/L+活性炭3.0g/L+琼脂4.5g/L+蔗糖\n30g/L。\n[0045] 此外，研究表明，将小与胡杨外植体叶片接种至图3所示的培养基中时，叶片除四周切口稍微膨大外，外管没有发生任何变化，说明采用叶片作为外植体不利于小与胡杨进行不定芽诱导与增殖培养。\n[0046] 3.生根培养\n[0047] 3.1生根材料接种\n[0048] 选取步骤2培养30～40天、生长健壮、高2～3cm的小与胡杨不定芽为试验材料，剪取后垂直接种于生根培养基中进行培养；对照为不加任何激素的1/2WPM基本培养基。\n[0049] 3.2培养条件\n[0050] 培养室温度设置为25℃，先暗培养4天，4天后逐渐增强光照强度且光照时间12h/d，培养40～50天后光照强度控制在1800～2200lx且光照时间12h/d。\n[0051] 3.3结果与分析\n[0052] 如图4所示，小与胡杨不定芽接种后,最早第9天开始在切口处产生愈伤组织，15天开始长出不定根，除对照处理以外，其它均能产生不定根，但不同处理中根系数量、植株高度、植株生长状况等有较大差异。IBA浓度为0.2mg/L时，生根率随着其它几种添加物的增多而逐渐增大；IBA为0.4mg/L的处理阶段，小与胡杨生根率均较大，分别为94.85％、84.57％、\n82.00％，之后，随培养基中IBA的增大生根率逐渐减小。因此，最适宜小与胡杨进行生根培养的培养基配方为1/2WPM+IBA0.4mg/L+蛋白胨1g/L+香蕉150g/L+活性炭3.0g/L琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L。\n[0053] 4.炼苗移栽\n[0054] 炼苗是试管苗室内培养与室外育苗的过渡阶段，主要目的是使幼苗在被移植至大田之前有一个适应外界环境的过程，该阶段要注意光照与温度的管理。\n[0055] 4.1瓶苗的锻炼\n[0056] 生根培养40～50天后，对试管苗进行炼苗移栽，选择生根培养后根系发达、生长健壮的试管苗，先将瓶盖打开1/2后注入100ml蒸馏水，室内自然光下放置3天后将瓶盖全部打开，添加50ml蒸馏水，继续置于室内自然光下2天，随后将瓶苗移至温室全部打开瓶盖后放置2天后，用自来水清洗瓶苗根部的培养基，清洗干净后移栽至蛭石、锯末、泥炭土三种按照不同的比例混合配比的基质中，移栽完成后放置在苗床上，苗床上部覆盖规格为50％～\n70％的双层遮荫网，避免阳光直射，每天傍晚进行喷灌浇水，保证营养钵内土壤湿度为60％～80％，试管苗移栽定植15天后，可根据土壤干湿情况适当增减浇水量，温室条件下生长30天后即可进行露地移栽定植。\n[0057] 4.2移植前的准备\n[0058] 4.2.1基质的准备\n[0059] 使用无土育苗基质，要求基质具有良好的保水保肥能力，透气性能好，PH5.5～\n6.5，物理化学性质稳定，最好经过灭菌。一般用2～3种基质混合使用，如草炭、蛭石按体积比2﹕1混合，如图5中的实验数据所示蛭、锯末、泥炭土的按体积比2:1:1混合而成的基质，植株的成活率最高，且植株生长健壮、叶片呈深绿色、生长速度较快，在移苗前1天，将混合好、已润湿的基质装入穴盘，轻压；用1000倍的普力克浇透，以杀死基质中残存的病原菌。第二天移苗时，基质含水量大约为80％，即适合移苗。\n[0060] 4.2.2苗床的准备\n[0061] 放置幼苗的环境应容易实现对湿度、温度与光照的控制。在日光温室内南北向做高畦，高10～15cm，宽120cm；可横向放置2个穴盘(54cm×2＝108cm)；在高畦上做小拱棚，除用于保温保湿外还可搭置遮阳网。\n[0062] 4.2.3工具的准备\n[0063] 起苗、移苗的过程中若自制一些适当的工具，不但可提高效率，还能提高成活率，如自制从培养瓶中将幼苗取出时所用的工具，自制幼苗移栽时的用具，等等。移苗量大时，还应考虑用工情况及人员、工作流程的安排等。\n[0064] 4.3幼苗的移植\n[0065] 4.3.1起苗、分级、洗苗\n[0066] 将培养瓶内的幼苗轻轻倒出，轻轻去除幼苗根部上粘着的培养基，放入清水中轻洗，将根部附着的培养基清洗干净，同时必须做到尽量不伤及根系、嫩芽及叶片。然后按大小将幼苗分级，并分出无根苗。\n[0067] 4.3.2移植\n[0068] 用准备好的工具在穴盘的基质上插洞，将幼苗根部轻轻放入洞中，尽量“不窝根”；\n轻轻掩上，稍压实。移完后用喷雾器轻喷水，即可冲洗幼苗叶片上的基质又使得根系与基质接触更紧密，利于根系生长。对于无根苗，可先沾适宜浓度的生根粉(剂)，再移植。\n[0069] 4.4移植后的管理\n[0070] 移苗后，幼苗所生长的环境需要保持高湿度，湿度应在85～95％，较高的湿度有利于减小叶片蒸腾速率，减轻根系吸水的负担。可在苗床上搭小拱棚，以有效保湿。但高湿度的同时易滋生病害，为减少病害的发生，每4～5h通风换气5min，并且逐天逐渐加大通风透气时间，约7天后可撒去用于保湿的小拱棚进行正常管理。移植后的环境温度应稍高于移植前幼苗生长的环境温度，白天可控制在23～26℃，夜间不低于13～18℃。为减小叶片蒸腾速率，移植后需进行遮光管理，移植后的前2天需遮光70％，之后逐渐见光，直至不遮光，此过程约需10～14天。由于环境湿度较大，温度适中，有利于滋生多种病菌。为防止病害的产生，除加强通风换气降湿外，还应结合药物防治与治疗。可在移苗后第4天喷施750倍的普力克，此后每隔4天喷施一次。可结合喷药进行补水，喷药补水后加大通风透气时间。1周后，结合补水进行施肥；可喷施高磷复合肥，浓度为0.2％，以促进根系与植株的全面生长。10天后可确定移植成活率。\n[0071] 需要强调的是：对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。