用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂及其制备方法和应用

1.一种用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂，其特征在于：该用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
（1）微生物培养：
a. 干酪乳杆菌的培养：
al. 培养基的制备：用水按质量比将糖蜜稀释8～10倍，再加入NH4Cl和KH2PO4，使糖蜜溶液中NH4Cl和KH2PO4的浓度均为1.0g/L，高温灭菌后制成培养基；
a2. 逐级扩大培养：根据需要的菌体培养物的量，采用逐级扩大培养，即取5～10μl原始干酪乳杆菌液体菌种接入100ml培养基，在33～35℃、140～160rpm的条件下培养
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10h～14h，培养后的干酪乳杆菌菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；若需要更大量的菌体培养物，则再按体积比为5～10％的接种量将之前已培养好的干酪乳杆菌种接到新的培养基中，在33～35℃、140～160rpm的条件下培养10～14h即可，培养后的干酪乳杆菌菌
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液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；
b. 植物乳杆菌的培养：
bl. 培养基的制备：用水按质量比将糖蜜稀释8～10倍，再加入NH4Cl和KH2PO4，使糖蜜溶液中NH4Cl和KH2PO4的浓度均为1.0g/L，高温灭菌后制成培养基；
b2. 逐级扩大培养：根据需要的菌体培养物的量，采用逐级扩大培养，即取原始植物乳杆菌液体菌种5～10μl 接入100ml培养基，在35～37℃、140～160rpm的条件下培养
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10～14h，培养后的植物乳杆菌菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；若需要更大量的菌体培养物，则再按体积比为5～10％的接种量将之前已培养好的植物乳杆菌种接到新的培养基中，在35～37℃、140～160rpm的条件下培养10～14h即可，培养后的植物乳杆菌菌
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液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；
c. 酿酒酵母的培养：
cl. 培养基的制备：用水按质量比将糖蜜稀释8～10倍，再加入NH4Cl和KH2PO4，使糖蜜溶液中NH4Cl的浓度为2.0g/L，KH2PO4的浓度为1.5g/L，高温灭菌后制成培养基；
c2. 逐级扩大培养：根据需要的菌体培养物的量，采用逐级扩大培养，即取5～10μl原始酿酒酵母液体菌种接入100ml培养基，在28～30℃、140～160rpm的条件下培养
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12h～16h，培养后的酿酒酵母菌液浓度为0.2×10~1.0×10cfu/ml；若需要更大量的菌体培养物，则再按体积比为5～10％的接种量将之前已培养好的酿酒酵母菌种接到新的培养基中，在28～30℃、140～160rpm的条件下培养12～16h即可，培养后的酿酒酵母菌液浓
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度为0.2×10~1.0×10cfu/ml；
d. 绿色木霉的培养：
d1. 培养基的制备：取去皮马铃薯，切成小块后加水煮沸25～35min，用纱布过滤后，取过滤液，按照每克马铃薯加入0.05～0.2g葡萄糖和0.08～0.1g琼脂糖计，向过滤液中加入葡萄糖和琼脂糖，再补水将过滤液定容，定容后的过滤液体积与马铃薯质量比例为
5～6ml：1g，高温灭菌后，倒平板制成固体培养基，取斜面保藏的原始绿色木霉点植于固体培养基，25～30℃、静置培养5天～7天，待菌丝表面长出大量孢子即可，每个平板取1～
3ml无菌生理盐水冲洗使菌丝表面的孢子脱落得到孢子悬液，再用无菌生理盐水将孢子悬
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液浓度稀释为0.2×10~1.0×10cfu/ml备用；
(2) 菌体和孢子混合液制备：
将培养好的干酪乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液、酿酒酵母悬液和绿色木霉孢子悬液，按体积比3：3：2：2的比例混合均匀，离心后去掉上层培养基，得到的菌体再用10~15％离心前菌液总体积的生理盐水混匀；
(3) 吸附干燥：
取步骤（2）得到的菌液，按1ml菌液：10g麦麸计取麦麸，将菌液均匀喷洒在麦麸表面，并充分混合，40℃以下风干至水分小于15％，得到菌剂。
2.根据权利要求1所述的用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂，其特征在于：步骤（1）微生物培养中，所述的高温灭菌是指在115～121℃下灭菌20～30min。
3.根据权利要求1或2所述的用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂，其特征在于：步骤（1）微生物培养中，所述的原始干酪乳杆菌是从酸奶制品中分离；原始植物乳杆菌是从自然发酵的芒草类青贮饲料中分离；原始酿酒酵母是从白酒厂酒糟分离；原始绿色木霉是从天然腐木上分离。
4.如权利要求1所述的用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂的应用，其特征在于：用
30～35℃的温水浸泡该微生物菌剂25～40min，得到的菌液与粉碎后的芒草类青饲料按重量比为1：95～1：105混合均匀后，按一般的青贮方法进行青贮保藏即可；所述的温水与微生物菌剂的重量比为450～500：1。

用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂及其制备方法和应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种微生物菌剂及其制备方法和应用，特别是一种用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂及其制备方法和应用。\n背景技术\n[0002] 青贮是指在密封条件下使青饲料发酵以能够在相当长的时间内保持其质量相对稳定的一种保鲜技术。青贮饲料是指易被耗氧微生物损坏的青草或其它水分含量高的原料贮存于厌氧条件下靠乳酸菌发酵制成能够长期保存的饲料。这种饲料能有效的保存青绿植物的营养成分，保证原料青绿时的鲜嫩汁液、质地柔软、适口性好、采食量大、消化利用率高，特别对牛羊等反刍动物来讲是一种非常好的饲料。青贮青贮后营养损失率8％~10％，而晒干保藏营养损失率达30％～50％甚至更高。青贮过程中由于微生物的作用，饲料纤维素含量可下降3％～6％，粗蛋白含量提高0.8％～2％。传统青贮由于利用的是青饲料自身所带的微生物进行发酵，因而品质很难控制，常常出现青贮失败的情况，从而导致饲料适口性差、品质下降。广西地区山地丘陵性众多，野生的芒草资源非常丰富，如何有效的利用这些资源用于反刍类动物的饲养具有很大的实际意义。\n[0003] 目前公开的专利文献中，中国专利号为ZL200610078589.2《一种复合微生物饲料添加剂及其生产方法和用途》公开了一种微生物饲料添加剂，包括酿酒酵母、植物乳杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种。该微生物是添加在动物饲料中，主要是为了提高饲料利用率和养殖动物机体免疫能力，减少患病几率和改善养殖动物的品质，降低动物饲养成本。与本发明专利申请的用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂的作用及用途均不相同。\n发明内容\n[0004] 本发明要解决的技术问题是：提供一种用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂及其制备方法和应用，采用该微生物菌剂用于芒草类青贮饲料的制作，缩短了芒草青贮饲料成熟时间，增加了蛋白含量，降低了纤维素含量，克服了上述现有技术中存在的不足之处。\n[0005] 解决上述技术问题的技术方案是：一种用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂，该微\n9 9\n生物菌剂是由干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) 0.3×10~1.5×10cfu/g、植物乳杆\n9 9\n菌 (Lactobacillus plantarum) 0.3×10~1.5×10cfu/g 、酿酒酵母(Saccharomyces \n8 9\ncerevisiae) 0.4×10 ~0.2×10cfu/g 和 绿 色 木 霉 (Trichoderma viride) \n8 9 9 9\n0.4×10~0.2×10cfu/g组成，微生物总量为0.68×10 ～3.4×10cfu/g。\n[0006] 该微 生 物 菌剂 是 由 干酪 乳 杆菌 1.0×109~1.2×109cfu/g、植 物 乳 杆\n9 9 9 9\n菌 1.0×10~1.2×10cfu/g 、酿 酒 酵 母 0.1×10~0.2×10cfu/g 和 绿 色 木 霉\n9 9 9 9\n0.1×10~0.2×10cfu/g组成，微生物总量为2.2×10 ～2.8×10cfu/g。\n[0007] 一种用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：\n[0008] （1）微生物培养：\n[0009] a. 干酪乳杆菌的培养：\n[0010] al. 培养基的制备：用水按质量比将糖蜜稀释8～10倍，再加入NH4Cl和KH2PO4，使糖蜜溶液中NH4Cl和KH2PO4的浓度均为1.0g/L，高温灭菌后制成培养基；\n[0011] a2. 逐级扩大培养：根据需要的菌体培养物的量，采用逐级扩大培养，即取5～\n10μl原始干酪乳杆菌液体菌种接入100ml培养基，在33～35℃、140～160rpm的条件下\n9 9\n培养10h～14h，培养后的干酪乳杆菌菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；若需要更大量的菌体培养物，则再按体积比为5～10％的接种量将之前已培养好的干酪乳杆菌种接到新的培养基中，在33～35℃、140～160rpm的条件下培养10～14h即可，培养后的干酪乳杆\n9 9\n菌菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；\n[0012] b. 植物乳杆菌的培养：\n[0013] bl. 培养基的制备：用水按质量比将糖蜜稀释8～10倍，再加入NH4Cl和KH2PO4，使糖蜜溶液中NH4Cl和KH2PO4的浓度均为1.0g/L，高温灭菌后制成培养基；\n[0014] b2. 逐级扩大培养：根据需要的菌体培养物的量，采用逐级扩大培养，即取原始植物乳杆菌液体菌种5～10μl 接入100ml培养基，在35～37℃、140～160rpm的条件下培\n9 9\n养10～14h，培养后的植物乳杆菌菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；若需要更大量的菌体培养物，则再按体积比为5～10％的接种量将之前已培养好的植物乳杆菌种接到新的培养基中，在35～37℃、140～160rpm的条件下培养10～14h即可，培养后的植物乳杆菌\n9 9\n菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；\n[0015] c. 酿酒酵母的培养：\n[0016] cl. 培养基的制备：用水按质量比将糖蜜稀释8～10倍，再加入NH4Cl和KH2PO4，使糖蜜溶液中NH4Cl的浓度为2.0g/L，KH2PO4的浓度为1.5g/L，高温灭菌后制成培养基；\n[0017] c2. 逐级扩大培养：根据需要的菌体培养物的量，采用逐级扩大培养，即取5～\n10μl原始酿酒酵母液体菌种接入100ml培养基，在28～30℃、140～160rpm的条件下培\n9 9\n养12h～16h，培养后的酿酒酵母菌液浓度为0.2×10~1.0×10cfu/ml；若需要更大量的菌体培养物，则再按体积比为5～10％的接种量将之前已培养好的酿酒酵母菌种接到新的培养基中，在28～30℃、140～160rpm的条件下培养12～16h即可，培养后的酿酒酵母菌液\n9 9\n浓度为0.2×10~1.0×10cfu/ml；\n[0018] d. 绿色木霉的培养：\n[0019] d1. 培养基的制备：取去皮马铃薯，切成小块后加水煮沸25～35min，用纱布过滤后，取过滤液，按照每克马铃薯加入0.05～0.2g葡萄糖和0.08～0.1g琼脂糖计，向过滤液中加入葡萄糖和琼脂糖，再补水将过滤液定容，定容后的过滤液体积与马铃薯质量比例为5～6ml：1g，高温灭菌后，倒平板制成固体培养基，取斜面保藏的原始绿色木霉点植于固体培养基上，25～30℃、静置培养5天～7天，待菌丝表面长出大量孢子即可，每个平板取\n1～3ml无菌生理盐水冲洗使菌丝表面的孢子脱落得到孢子悬液，再用无菌生理盐水将孢\n9 9\n子悬液浓度稀释为0.2×10~1.0×10cfu/ml备用；\n[0020] (2) 菌体和孢子混合液制备：\n[0021] 将培养好的干酪乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液、酿酒酵母悬液和绿色木霉孢子悬液，按体积比3：3：2：2的比例混合均匀，离心后去掉上层培养基，得到的菌体再用10~15％离心前菌液总体积的生理盐水混匀；\n[0022] (3) 吸附干燥：\n[0023] 取步骤（2）得到的菌液，按1ml菌液：10g麦麸计取麦麸，将菌液均匀喷洒在麦麸表面，并充分混合，40℃以下风干至水分小于15％，得到菌剂。\n[0024] 步骤（1）微生物培养中，所述的高温灭菌是指在115～121℃下灭菌20～30min。\n[0025] 步骤（1）微生物培养中，所述的原始干酪乳杆菌是从酸奶制品中分离；原始植物乳杆菌是从自然发酵的芒草类青贮饲料中分离；原始酿酒酵母是从白酒厂酒糟分离；原始绿色木霉是从天然腐木上分离。\n[0026] 本发明所述的微生物菌剂可用在芒草类青贮饲料中，其具体使用方法是：用30～\n35℃的温水浸泡该微生物菌剂25～40min，得到的菌液与粉碎后的芒草类青饲料按重量比为1：95～1：105混合均匀后，按一般的青贮方法进行青贮保藏即可；所述的温水与微生物菌剂的重量比为450～500：1。\n[0027] 采用本发明之微生物菌剂用于芒草类青贮饲料的制作，青贮成熟时间比自然发酵缩短4~8天；青贮5个月后，纤维素含量比自然发酵的青贮饲料降低3％～5％，粗蛋白含量比自然发酵的青贮饲料增加5％～10％。即采用本发明之微生物菌剂用于芒草类青贮饲料的制作，能缩短芒草青贮饲料成熟时间，降低饲料变质的几率，增加蛋白含量，降低纤维素含量，增强适口性。\n[0028] 另外，糖蜜是工业制糖过程中，蔗糖结晶后，剩余的不能结晶，但仍含有较多糖的液体残留物，它是制糖工业的副产物。很多制糖厂是将糖蜜作为废料进行处理。而本发明采用糖蜜进行微生物的培养，即实现了废料的循环使用，不仅菌剂的制备成本低，而且也为糖厂在一定程度上解决了废料糖蜜的处理问题，有利于环境保护。\n[0029] 下面，结合实施例对本发明之用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂及其制备方法和应用的技术特征作进一步的说明。\n具体实施方式\n[0030] 实施例1：用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂，由以下菌种构成：\n[0031] 干酪乳杆菌1.5×109cfu/g\n[0032] 植物乳杆菌1.5×109cfu/g \n[0033] 酿酒酵母0.2×109cfu/g\n[0034] 绿色木霉0.2×109cfu/g\n[0035] 微生物总量为3.4×109cfu/g。\n[0036] 实施例2：用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂，由以下菌种构成：\n[0037] 干酪乳杆菌0.3×109cfu/g\n[0038] 植物乳杆菌0.3×109cfu/g \n[0039] 酿酒酵母0.4×108cfu/g\n[0040] 绿色木霉0.4×108cfu/g\n[0041] 微生物总量为0.68×109cfu/g。\n[0042] 实施例3：用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂，由以下菌种构成：\n[0043] 干酪乳杆菌1.0×109cfu/g\n[0044] 植物乳杆菌0.4×109cfu/g \n[0045] 酿酒酵母0.1×109cfu/g\n[0046] 绿色木霉0.2×109cfu/g\n[0047] 微生物总量为1.7×109cfu/g。\n[0048] 实施例4：用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂，由以下菌种构成：\n[0049] 干酪乳杆菌0.8×109cfu/g\n[0050] 植物乳杆菌1.0×109cfu/g \n[0051] 酿酒酵母0.15×109cfu/g\n[0052] 绿色木霉0.8×108cfu/g\n[0053] 微生物总量为2.03×109cfu/g。\n[0054] 实施例5：用于芒草类青贮饲料的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：\n[0055] （1）微生物培养：\n[0056] a. 干酪乳杆菌的培养：\n[0057] al. 培养基的制备：用水按质量比将糖蜜稀释8～10倍，再加入NH4Cl和KH2PO4，使糖蜜溶液中NH4Cl的浓度为1.0g/L，KH2PO4的浓度为1.0g/L，121℃灭菌20min制成培养基；\n[0058] a2. 逐级扩大培养：取10μl原始干酪乳杆菌液体菌种接入100ml培养基，33℃、\n9 9\n150rpm培养10h～14h，培养后得到的干酪乳杆菌菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；\n将培养好的菌液30mL转接入300ml新培养基中，33℃、150rpm培养10h～14h，培养后得到\n9 9\n的干酪乳杆菌菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml。\n[0059] b. 植物乳杆菌的培养：\n[0060] bl. 培养基的制备：用水按质量比将糖蜜稀释8～10倍，再加入NH4Cl和KH2PO4，使糖蜜溶液中NH4Cl的浓度为1.0g/L， KH2PO4的浓度为1.0g/L，121℃灭菌20min制成培养基；\n[0061] b2. 逐级扩大培养：取10μl原始植物乳杆菌液体菌种接入100ml培养基，37℃、\n9 9\n150rpm培养10h～14h，培养后得到的植物乳杆菌菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml；\n将培养好的菌液30mL转接入300ml新培养基中，37℃、150rpm培养10h～14h，培养后得到\n9 9\n的植物乳杆菌菌液浓度为1.0×10~5.0×10cfu/ml。\n[0062] c. 酿酒酵母的培养：\n[0063] cl. 培养基的制备：用水按质量比将糖蜜稀释8～10倍，再加入NH4Cl和KH2PO4，使糖蜜溶液中NH4Cl的浓度为2.0g/L，KH2PO4的浓度为1.5g/L，121℃灭菌20min制成培养基；\n[0064] c2. 逐级扩大培养：取10μl原始酿酒酵母液体菌种接入100ml培养基，28℃、\n9 9\n150rpm培养12h～16h，培养后的酿酒酵母菌液浓度为0.2×10~1.0×10cfu/ml；将培养好的菌液20ml转接入200ml新培养基中，28℃、150rpm培养12h～16h，培养后的酿酒酵母\n9 9\n菌液浓度为0.2×10~1.0×10cfu/ml。\n[0065] d. 绿色木霉的培养：\n[0066] d1. 培养基的制备：采用马铃薯葡萄糖培养基培养，取200g去皮马铃薯，切成小块，加入锅中加水煮沸30min，用2层纱布过滤后，取过滤液并加入20g葡萄糖，20g琼脂糖，补足水将过滤液定容到1000ml，121℃灭菌20min后，倒平板制成固体培养基。取斜面保藏的原始绿色木霉菌种点植于固体培养基， 28℃、静置培养5天～7天，待菌丝表面长出大