一种促进神经再生的中药组合物及其制备方法和应用

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一种促进神经再生的中药组合物及其制备方法和应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种促进神经再生的中药组合物及其制备方法和应用。\n背景技术\n[0002] 脑缺血损伤相关疾病包括中风、中风后遗症、血管性痴呆。缺血性中风是威胁人类健康的重要杀手，在中老年人群发病率很高。全国估计约有缺血性中风病人高达近5百万人，全球更是高达2千万人以上，而且发病年龄是越趋年轻化，许多缺血性中风病人丧失劳动能力，严重损害社会劳动力和创造力。\n[0003] 老年痴呆是老年常见病，有血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）和老年性痴呆（Alzheimer disease，AD）等不同类型。血管性痴呆是老年痴呆的一种重要类型，也是缺血性中风的后遗症之一，在缺血性脑血管疾病患者中相当普遍，在60岁以上人群中患病率可达10%以上，严重影响老年人生活质量。随着我国人口的逐渐老龄化，缺血性中风和VD患者在不断增加。\n[0004] 国内每年用于缺血性中风和血管性痴呆的治疗费用高达上200亿元，全球更是高达数百亿美元，给家庭社会带来沉重负担。但迄今为止，对缺血性中风和VD尚无特效的治疗和预防药物。有效预防和治疗心脑血管疾病已成为摆在我们面前的一个严重而艰巨的课题。\n[0005] 中医药理论认为脑缺血中风和老年痴呆特别是血管性痴呆的病机是:一为虚，即真阴素亏，正气不足；二为实，气逆血瘀于上，蒙蔽脑神。即年老肾虚，气虚血瘀、而致脑脉络受瘀血阻滞，血流不畅、髓海空虚、脑衰健忘。治宜补气益肾健脑、活血化瘀。\n[0006] 中医药对治疗缺血性中风和血管性痴呆有独特效果。但目前具有独特疗效的治疗缺血性中风疾病和血管性痴呆的中成药甚少，且经严格疗效评价、高效、安全、质量可控的有效治疗缺血性中风和血管性痴呆现代中成药更是缺欠。现有的防治缺血性中风疾病和血管性痴呆的中成药普遍存在大复方、组成药味多、有效成分复杂、生产工艺不稳定、质量难于控制、疗效难于保证等到缺陷，难于符合现代中药要求。未来市场上那些成分复杂不明、无法或难于进行有效质量控制、作用机理不清、疗效不确切的老中成药产品将被淘汰；单方制剂和单方有效部位制剂，虽然成分明了，作用明确，质量可控，但面对病因病机复杂的脑缺血性疾病（中风）和老年痴呆等难治性疾病显然难于获得满意疗效。而中医药理论指导下的小复方新药将有望解决大复方中成药和中药单方制剂和单方有效部位制剂所面对的困惑，而研究开发处方组成精简、有效成分相对明确、质量易于控制而且生产工艺稳定、安全有效的小复方现代中药制剂或中药有效组分新药已成为未来发展之方向。\n[0007] 中国专利200810198306.7（公开日2009年2月4日）公开了一种脑缺血疾病和血管性痴呆的药物和保健品，由人参皂苷Rb1 2~10份、人参皂苷Rg1 2~10份、人参皂苷Rd \n2~10份、人参皂苷Re 2~10份、二苯乙烯苷2~10份、银杏内酯2~10份、山柰酚与槲皮素混合物2~10份等植物有效组分组成。是经筛选而得的植物有效组分配伍，用于脑缺血疾病和血管性痴呆取得理想疗效，实验研究也表明，该方对实验性的防治脑缺血疾病（脑动脉硬化、缺血性脑卒中、中风后遗症）和血管性痴呆疗效确切，具有很好的抗脑缺血损伤、改善学习记忆作用，该处方专利已经获得授权。\n[0008] 虽然该配方具有很好的抗脑缺血损伤、改善学习记忆的作用，但是由于该配方是纯化学成分配方，各成分原料来源受到一定制约，制造成本相对昂贵，广泛应用受到限制。\n[0009] 促进神经再生是治疗脑缺血性疾病的一种新治疗趋势和未来的发展方向，但是关于这方面的中药还罕见报道。\n发明内容\n[0010] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种原料易得，制备方法简便，疗效显著的促进神经再生的中药组合物，命名为乌参醒脑方，简称WSXN。\n[0011] 本发明的另一目的是提供上述中药组合物的制备方法。\n[0012] 本发明的又一目的是提供上述中药组合物的应用。\n[0013] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：\n[0014] 一种促进神经再生的中药组合物，是由以下组份和重量份数组成：首乌2~10、人参1~10和银杏叶1~10。\n[0015] 以上促进神经再生的中药组合物也可以用市购的首乌提取物2~10重量份、人参提取物1~10重量份和银杏叶提取物1~10重量份组成。\n[0016] 作为一种优选方案，该促进神经再生的中药组合物由以下组份和重量份数组成：\n首乌2~5、人参1~5和银杏叶1~5。\n[0017] 更进一步，上述促进神经再生的中药组合物可以是将三种原料药物经过C1-3醇提后制备成提取物再混合组成，具体原料药物首乌2~5重量份、人参1~5重量份和银杏叶1~5重量份。\n[0018] 上述促进神经再生的中药组合物还可以直接选用含有首乌、人参和银杏叶的提取物的主要有效成分组成，有效成分及重量比为：二苯乙烯苷:人参皂苷Rb1:人参皂苷Rg1:\n人参皂苷Rd:人参皂苷Re:银杏内酯:山柰酚:槲皮素等于1~18:1~10:1~10:1~2:1~4: \n1~4: 1~2:1~2。\n[0019] 上述促进神经再生的中药组合物可以直接用水混合煎煮得汤药服用，也可以用C1-3醇单独或混合提取、合并、浓缩、干燥混合成提取物组合物。\n[0020] 下面提供一种优选提取制备方案，步骤如下：\n[0021] 将原料药物首乌、人参和银杏叶按配比称取后分别经过C1-3醇提取后，得到C1-3醇提物，合并总提取物，总提取物经过浓缩后得到浓缩液，浓缩液加于已处理好的大孔吸附树脂上，依次用不同浓度的乙醇洗脱，收集相应洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎，即得已经除去浓缩液中非皂苷类、非二苯乙烯苷类、非银杏内酯类和非黄酮类等杂质成分，得到原料药物的最终提取物，将三种原料药物的最终提取物混合，即得到所述促进神经再生的中药组合物。\n[0022] 所述C1-3醇提是用30~95体积%的C1-3醇提取1~5次，每次提取的C1-3醇体积为药材质量的1~15倍，每次提取时间为5min~5h；所述C1-3醇为甲醇、乙醇或丙醇。\n[0023] 所述大孔吸附树脂与浓缩液的用量比是1kg大孔树脂加浓缩液1~5L。\n[0024] 所述乙醇洗脱是用50~95体积%乙醇，用量为每1kg大孔树脂用5~20 L乙醇溶液，以1~20 ml/min流速洗脱，洗脱至无色；所述大孔树脂为聚酰胺型树脂或聚苯乙烯弱碱性阴离子交换树脂。\n[0025] 以上所述任意一种中药组合物在制备促进神经再生的药物和/或保健食品中的应用。\n[0026] 上述中药组合物在制备防治脑缺血损伤疾病或老年痴呆疾病药物和/或保健食品中的应用。所述脑缺血损伤疾病包括脑卒中、脑血栓形成、动脉硬化、中风后遗症和血管性痴呆等，所述老年痴呆疾病为原发性老年性痴呆（Alzheimer症）和/或血管性痴呆。\n[0027] 中医药理论认为人参为名贵中药，性平，味甘，微苦。具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神益智之功能。用于体虚欲脱、肢冷脉微、久病虚羸、惊悸失眠、心力衰竭、心原性休克等。\n[0028] 现代医学研究证明，人参的有效成分为人参皂甙，药用价值极高，具有抗衰老、益智、安神、延寿等功效 。通常用于治疗心血管疾病、健忘失眠等。药理研究表明人参、人参总皂甙及其各单体皂甙可改善心脑血管系统功能，对大鼠、小鼠、沙土鼠等多种动物的急慢性脑缺血再灌注损伤有明显保护作用、还能调节神经系统功能和免疫功能，提高脑细胞耐缺氧能力和抗应激功能，提高脑缺血沙土鼠神经干细胞存活率和学习记忆能力，改善暂时性脑缺血引起学习记忆障碍模型小鼠学习能力，此外还能降血脂，广泛应用于中风和血管痴呆的防治。\n[0029] 首乌又名何首乌，性温，味苦、甘、涩，入肝、肾经。制首乌为滋补良药，具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨等功能，可用于血虚萎黄、眩晕耳呜、须发早白、腰膝酸软、肢体麻木。现代药理研究表明，首乌具有延缓衰老、抗动脉硬化和脑缺血等作用。\n[0030] 首乌中含有活性成分二苯乙烯苷具有脑保护作用；能够改善缺血再灌注所导致的沙土鼠学习记忆功能障碍，并对多种拟痴呆细胞模型有神经保护作用；对实验性动脉粥样硬化大鼠血脂和炎症因子也有调节作用。\n[0031] 人参和首乌是中医药治疗脑缺血中风和老年痴呆的常用中药，成分和功效已相对明确，并且有人参首乌胶囊这一国家标准中成药，具有补肝肾，益气血功能。用于气血虚弱，须发早白，神经衰弱，健忘失眠，食欲不振，疲劳过度等。但人参首乌方制剂其疗效有等进一步评价和提高，主要是人参、首乌活血功能不强，影响疗效。我们认为佐以活血类中药，将能显著提高药效。\n[0032] 银杏叶，性平、味甘、苦、涩，归心、肺经。具有活血化瘀、止痛之功效，用于冠心病、心绞痛、高脂血症。近十多年来发现而在这场人类防止脑缺血损伤的攻坚战中，银杏制剂异军突起，倍受世界关注。银杏的主要有效成分为银杏酮酯和黄酮。其制剂杏灵颗粒、金纳多片等具有活血化瘀、通脉舒络之功能，主要用于血瘀引起的卒中、胸痹（冠心病）等症，症见：\n胸闷心悸、舌强语蹇、半身不遂、偏身麻木、口舌歪斜、痴呆等。但单一银杏叶提取物制剂因毒性成分银杏酸的存在而使其使用受到限制，其药效和疗效仍有待进一步提高。\n[0033] 我们长期研究发现，人参和首乌，配伍银杏叶，抗缺血性脑组织损伤和促进神经再生和改善学习记忆作用显著增强。三者合用药效显著好于人参和首乌、人参和银杏叶或银杏叶、人参、首乌单独的作用。而且人参、首乌、和银杏叶合用时，人参皂苷和二苯乙烯苷等活性成分加快进入脑组织，并增加它们在脑组织中浓度和生物利用度。\n[0034] 另外，银杏黄酮成分能促进人参首乌活性成分二苯乙烯苷、人参皂苷Rb1 、Rg1、Rd、Re进入脑组织发挥作用。人参和首乌，配伍银杏叶，药效作用显著提高；并可减少毒性成分银杏酸的份额，降低毒副作用，增强促进神经再生、抗脑缺血损伤和改善学习记忆的药效。药理上有协同作用、能发挥更好的抗脑缺血损伤和神经保护及促进神经再生作用。\n[0035] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：\n[0036] 本发明的中药组合物具有优良的促神经再生作用，并具有突出的抗脑缺血损伤、神经保护、改善学习记忆作用，而且主要活性成分明确，质量稳定，使用剂量少，可制成各种控制释放制剂和进行大规模生产，是一种优良的天然药物和/或保健食品。\n[0037] 本发明的药物原料种类少、制备方法简单易操作，具有广泛应用价值。\n附图说明\n[0038] 图1. 实施例1的中药组合物提取物（WSXN）经UHPLC-MS分析得到的指纹图谱；\n[0039] 图2. 实施例1的中药组合物提取物（WSXN）经HPLC析得到的黄酮类组分指纹图谱；\n[0040] 图3. 不同药物对全脑缺血大鼠的体重变化率影响分析图；\n[0041] 图4. 大鼠脑海马组织HE染色切片显微镜图；\n[0042] 图5. 大鼠脑海马组织CA1区锥体神经细胞显微镜图；\n[0043] 图6. 各药物对脑缺血再灌注大鼠学习记忆（定向航行实验潜伏时间）的影响分析图；\n[0044] 图7. 各药物对脑缺血再灌注大鼠空间探索学习记忆（穿越平台次数）的影响分析图；\n[0045] 图8. 各药物处理后大鼠海马组织行BrdU单标免疫组化反应（示神经再生）共聚焦激光扫描显微镜照片效果。\n具体实施方式\n[0046] 以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。（以下所述乙醇均按体积百分比计算）\n[0047] 实施例1 中药复方总提取物的制备（WSXN1）\n[0048] 首乌100 kg，人参90 kg，银杏叶60 kg。\n[0049] 取处方量的人参，粉碎成粗粉，分别以药材量的10倍、8倍和6倍的60 %乙醇回流各提取3次，每次2 h，合并提取液，真空减压回收乙醇并使醇提部分浓度为1 ml相当于1 g生药。\n[0050] 银杏叶处理方法与人参相同，最终醇提部分浓度为1 ml相当于1 g生药。\n[0051] 首乌以药材量的10倍、8倍和6倍的水，分别煎煮提取3次，每次2 h，合并3次水提液，真空减压浓缩至1ml提取液相当于1 g生药材，加95%乙醇使含醇量达70%，静置过夜，滤过取乙醇溶液真空减压回收乙醇，浓缩得至1 g药材/ml浓缩醇提取液，与前述人参、银杏醇提部分合并得到总醇提取物浓缩液。\n[0052] 将总醇提物浓缩液加到已处理好的大孔吸附树脂（PD100聚苯乙烯弱碱性阴离子交换树脂）上，大孔树脂与浓缩液的用量比是1kg大孔树脂加浓缩液2L。依次用50%、70%、\n80%及95 %乙醇洗脱，用量分别是4，4，4，4 L，以10 ml/min流速洗脱，收集相应洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎即得最终提取物（WSXN1）10.1 kg。\n[0053] 经UHPLC-MS测定分析该提取物（WSXN1）含有二苯乙烯苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、银杏内酯、山柰酚与槲皮素等。它们的含量如表1所示。\n[0054] 表1 WSXN1 的HPLC含量测定结果\n[0055] \n[0056] 实施例2 中药复方总提取物制备（WSXN1-2）\n[0057] 首乌100 kg，人参90 kg，银杏叶60 kg。\n[0058] 上述药材，粉碎成粗粉，分别以药材量的12倍、10倍和6倍的水，分别沸煮2 h、1.5 h 和1 h, 过滤，合并滤液，减压80℃以下浓缩至1 ml 相当于含1g 生药，加入95%乙醇使含醇量达70%，静置过夜，滤过取乙醇溶液真空减压回收乙醇，浓缩得至1g药材/ml浓缩醇提取液，将总醇提物浓缩液加到已处理好的大孔吸附树脂（PD100聚苯乙烯弱碱性阴离子交换树脂）上，大孔树脂与浓缩液的用量比是1kg大孔树脂加浓缩液2L。依次用50%、70%、\n80%及95 %乙醇洗脱，用量分别是4，4，4，4 L，以10 ml/min流速洗脱，收集相应洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎即得最终提取物（WSXN1-2）9.61 kg。\n[0059] 经UHPLC-MS测定分析该提取物（WSXN1-2）含有二苯乙烯苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、银杏内酯、山柰酚与槲皮素等。它们的含量如表2所示。\n[0060] 表2 WSXN1-2 的HPLC含量测定结果\n[0061] \n[0062] 实施例3 首乌、人参、银杏叶提取物的制备\n[0063] 1首乌提取物1的制备\n[0064] 取500 kg首乌粉碎成粗粉，分别以药材质量的10倍、8倍和6倍重的70 %乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，真空减压回收乙醇并使醇提部分浓度为1 ml相当于1 g生药的总醇提取物；总醇提取物加于已处理好的大孔吸附树脂（PD100聚苯乙烯弱碱性阴离子交换树脂）上，大孔树脂与总醇提取物的用量比是1kg大孔树脂加总醇提取物2L。依次用50%、70%、80%及95%乙醇洗脱，用量均为4 L，以10 ml/min流速洗脱，收集相应洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎即得首乌提取物1（简称为EHSW1）。首乌提取物1的得率在5.1%；其中二苯乙烯苷含量为20.8%。\n[0065] 2 首乌提取物2的制备\n[0066] 取500kg的首乌粉碎成粗粉，分别以药材质量的10倍、8倍和6倍重的水，分别煎煮提取3次，每次2 h，合并3次水提液，真空减压浓缩至1 g药材/ml提取液，加95%乙醇使含醇量达70%，静置过夜，滤过取乙醇溶液真空减压回收乙醇，浓缩得浓缩液。并使醇提部分浓度为1 ml相当于1 g生药的首乌粗提取物；浓缩液加于已处理好的大孔吸附树脂（PD100聚苯乙烯弱碱性阴离子交换树脂）上，大孔树脂与浓缩液的用量比是1kg大孔树脂加浓缩液2L。依次用50%、70%、80%及95 %乙醇洗脱，用量均为4 L，以10 ml/min流速洗脱，收集相应洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎即得首乌提取物2（简称为EHSW2）。首乌提取物2的得率在10%；其中二苯乙烯苷含量为10.2%。\n[0067] 3 人参提取物1的制备\n[0068] 取500 kg的人参粉碎成粗粉，以药材质量的10倍、8倍和6倍重的60 %乙醇分别回流各提取3次，每次2 h，合并提取液，真空减压回收乙醇并使醇提部分浓度为1 ml相当于1 g生药，得到浓缩液；加于已处理好的大孔吸附树脂（PD100聚苯乙烯弱碱性阴离子交换树脂）上，大孔树脂与浓缩液的用量比是1kg大孔树脂加浓缩液2.5L。依次用60%、70%、\n80%及95 %乙醇洗脱，用量均为5 L，以12 ml/min流速洗脱，收集相应洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎即得人参提取物1(ERS1)。提取物的得率在5%；其中人参总皂苷含量为30.3%。\n[0069] 4 人参提取物2的制备\n[0070] 取500 kg的人参粉碎成粗粉，以药材质量的10倍、8倍和6倍的75 %丙醇分别回流各提取3次，每次2 h，合并提取液，真空减压回收丙醇并使醇提部分浓度为1 ml相当于\n1 g生药；加于已处理好的大孔吸附树脂（PD800聚苯乙烯弱碱性阴离子交换树脂）上，大孔树脂与醇提液的用量比是1kg大孔树脂加醇提液2.2L。依次用60%、70%、80%和95 %乙醇洗脱，用量分别是4.5，4，3.5，4 L，以10 ml/min流速洗脱，收集相应洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎即得人参提取物2(ERS2)。提取物的得率在\n4.32%；其中人参总皂苷含量为29.6%。\n[0071] 5 银杏叶提取物1的制备\n[0072] 取500 kg的银杏叶粉碎成粗粉，以药材质量的10倍、8倍和6倍的70 %乙醇分别回流提取3次，各次分别2.0 h、1.5 h和1.5 h，合并各提取液，真空减压回收乙醇并使醇提部分浓度为1 ml相当于1 g生药，加于已处理好的大孔吸附树脂（PD800聚苯乙烯弱碱性阴离子交换树脂）上，大孔树脂与醇提液的用量比是1kg大孔树脂加醇提液2.2L。依次用\n60%、70%、80%和95 %乙醇洗脱，用量分别是4.5，4，3.5，4 L，以10 ml/min流速洗脱，收集相应洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎即得银杏叶提取物1（EGB1），得率在 2.5%；银杏内酯含量为6.2%、山柰酚含量为5.6%、槲皮素含量为5.8% 银杏酸含量为<5 ppm。\n[0073] 6 银杏叶提取物2的制备\n[0074] 取500 kg的银杏叶粉碎成粗粉，以药材质量10倍、8倍和6倍重的70 %乙醇分别回流提取3次，各次分别2.0 h，1.5 h，1.5 h，合并提取液，真空减压回收乙醇并使醇提部分浓度为1 ml相当于1 g生药，调pH值为6.0，加于已处理好的大孔吸附树脂（聚酰胺型树脂）上，大孔树脂与浓缩液的用量比是1kg大孔树脂加醇提液2.0L。依次用60%、70%、\n80%和95%乙醇洗脱，用量分别是4.5 L，5 L，3.5 L，3 L，以10 ml/min流速洗脱，收集相应\n70%，80%乙醇洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎即得银杏叶黄酮提取物2-A（EGB2-A）2.25 kg，得率在 0.45%。其中山柰酚含量为15.1%，槲皮素含量为16.0%，银杏酸含量为<5 ppm。\n[0075] 上述60%乙醇和95%乙醇洗脱液收集相应洗脱液，回收乙醇并使醇提部分浓度为\n1 ml相当于1 g生药，调pH值为8.0，加于已处理好的大孔吸附树脂（PD800聚苯乙烯弱碱性阴离子交换树脂）上，大孔树脂与醇提液的用量比是1kg大孔树脂加醇提液2.0L。依次用60%、70%、80%和95%乙醇洗脱，用量分别是4.5 L，4 L，3.5 L，5 L，以10 ml/min流速洗脱，收集相应洗脱液，回收乙醇，干燥；或回收乙醇，浓缩成稠膏药，真空干燥，粉碎即得银杏叶内酯提取物2-B（EGB2-B）2.35 kg，得率在 0.47%。其中银杏内酯含量为40.8%，山柰酚含量为2.7%，槲皮素含量为2.8%，银杏酸含量为<5 ppm。\n[0076] 实施例4 乌参醒脑方2（WSXN2）的制备\n[0077] 选用实施例3中所得各提取物：\n[0078] 首乌提取物1（二苯乙烯苷含量为20.8%）9 kg；\n[0079] 人参提取物1（人参总皂苷含量为30.3%）9 kg；\n[0080] 银杏叶提取物1（银杏内酯含量为6.2%、山柰酚含量为5.6%、槲皮素含量为5.8% 银杏酸含量为<5 ppm）3.6 kg。\n[0081] 称取处方量上述三种提取物，按等量递增法混合均匀。即得一种促进神经再生、防治脑缺血疾病和老年痴呆的复方中药提取物（WSXN2），经UHPLC-MS分析得到的指纹图谱如附图1、图2所示，该提取物经测定含有二苯乙烯苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、银杏内酯、山柰酚与槲皮素等成分。它们的含量如表3所示。\n[0082] 表3 WSXN2的HPLC含量测定结果\n[0083] \n[0084] 实施例5 乌参醒脑方3（WSXN3）的制备\n[0085] 选用实施例2中所得各提取物：\n[0086] 首乌提取物2（二苯乙烯苷含量为10.2%）15kg；\n[0087] 人参提取物2（人参总皂苷含量为29.6%）10kg；\n[0088] 银杏叶提取物2[银杏内酯提取物(EGB2-B，含量为40.8%)1.0g+银杏黄酮提取物(EGB2-A，山柰酚含量为15.1%、槲皮素含量为16.0%)] 3 kg。\n[0089] 称取处方量上述三种提取物，按等量递增法混合均匀。即得一种促进神经再生、防治脑缺血疾病和老年痴呆的复方中药提取物（WSXN3），UHPLC-MS分析，经测定该提取物含有二苯乙烯苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、银杏内酯、山柰酚与槲皮素等。它们的含量如表4所示。\n[0090] 表4 WSXN3 的HPLC含量测定结果\n[0091] \n[0092] 实施例6 乌参醒脑方4（WSXN4）的制备\n[0093] 首乌提取物9 kg（二苯乙烯苷含量20.5%、由浙江宁波华立植物开发有限公司购进）；\n[0094] 人参提取物9 kg（总皂苷含量30.5%，从吉林省宏久生物科技股份有限公司购进）；\n[0095] 银杏叶提取物3.5kg[总银杏内酯含量6.1%;总黄酮24.3%(槲皮素含量4.8%和山柰酚含量4.6%)，银杏酸<5ppm；由浙江华立植物开发有限公司购进]。\n[0096] 取首乌提取物、人参皂苷提取物、银杏叶提取物、按等量递增法混匀制成一种促进神经再生、防治脑缺血疾病和血管性痴呆的复方中药提取物组合物(WSXN4) 21.5kg。\n[0097] 进行UHPLC-MS分析，经测定该组合物含有二苯乙烯苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、银杏内酯、山柰酚与槲皮素。它们的含量如表5所示。\n[0098] 表5 WSXN4 的HPLC含量测定结果\n[0099] \n[0100] 实施例7 乌参醒脑滴丸（WSXN5）的制备\n[0101] 乌参醒脑方2（WSXN2）7 kg，PEG-6000 7 kg，PEG-4000 7kg, 按滴丸常规制法制成每粒72mg滴丸，抛光，质检包装。共制得乌参醒脑滴丸29.16万粒，每粒含WSXN2 24mg。 [0102] 用HPLC方法测定滴丸(SWXN5)中各有效成分含量，结果如下表：\n[0103] 表6 WSXN5 的HPLC含量测定结果\n[0104] \n[0105] 用此滴丸胶囊进行临床试用治疗血管性痴呆，每天3次，每次10粒，连服90天，结果病人记忆力在治疗组治疗后有明显加强，总有效率为76.7%。\n[0106] 实施例8乌参醒脑片（WSXN6）的制备\n[0107] 取实施例1的提取物WSXN1 8kg，加淀粉5kg，糊精7kg，混匀，加75%酒精制粒，\n60℃干燥，整粒，加硬脂酸镁适量，压片，包欧巴代或其它薄膜衣，共制得100万片。每片重\n0.20g，含WSXN1 80mg/片，用HPLC方法测定，每片中各有效成分含量结果如下：\n[0108] 表7 乌参醒脑片（WSXN6）的HPLC含量测定结果\n[0109] \n[0110] 实施例9乌参醒脑软胶囊（WSXN7）的制备\n[0111] 组合物WSXN1 7.2 kg，明胶 7.2 kg，大豆油 7.2 kg，按软胶囊常规制法制成每粒重0.36g的软胶囊，质检包装。共制得乌参醒脑软胶囊12万粒，每粒含WSXN1120mg。用HPLC方法测定软胶囊WSXN7中各有效成分含量,结果如下表。\n[0112] 表8 乌参醒脑片（WSXN7）的HPLC含量测定结果\n[0113] \n[0114] 用此软胶囊进行临床试用治疗动脉硬化症，每天3次，每次2粒，连服90天，结果病人记忆力在治疗组治疗后有明显加强，总有效率为76.7%。\n[0115] 实施例10 乌参醒脑胶囊（WSXN8）的制备\n[0116] 将WSXN3组合物15 kg，加淀粉9 kg，糊精6 kg混合均匀后干法制粒，60℃干燥，整粒，填充2号胶囊，抛光，质检包装。每粒重0.25g，共制得胶囊12万粒，每粒0.25g，含WSXN3 0.125g/粒。 \n[0117] 用HPLC方法测定复方乌参醒脑胶囊中各有效成分含量，结果如下表。\n[0118] 表9 乌参醒脑胶囊（WSXN8）的HPLC含量测定结果\n[0119] \n[0120] 用此胶囊进行临床试用治疗血管性痴呆,每天3次，每次1粒，连服90天，结果病人记忆力在治疗组治疗后有明显加强，总有效率为76.7%。\n[0121] 当然，本发明不限于上述的剂型，也可以制成注射剂，但需进一步做毒性等药效试验。如WSXN添加助溶剂，按粉针剂要求制成粉针剂。每瓶含WSXN240mg。\n[0122] 实施例11 乌参醒脑方抗脑缺血损伤、改善学习记忆的作用\n[0123] 1. 实验材料\n[0124] 实验药物：实施例1乌参醒脑方（WSXN1）和人参首乌提取物（简称RSSW）由广东药学院中医药研究院提供，阳性对照药金纳多片（EGB761，德国威玛舒培博士药厂生产）；应用时用1% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）将各药物配制成混悬液灌胃。\n[0125] 试剂：无水乙醇、二甲苯、石蜡、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醛、氯化钠等均为国产分析纯。 \n[0126] 仪器：电热恒温培培养箱（上海），Leica RM2135轮转式组织切片机（德国），光学显微镜（Olympus BX51）。\n[0127] 实验动物：雄性、体重220~280g的Sprague-Dawley大鼠，清洁级标准，由南方医科大学实验动物中心提供（合格证号：粤检证字第2008A053号）。实验温度控制在25±1℃，灯光控制12小时光，12小时暗，自由饮水和食用动物饲料。饲养3天后开始实验。\n[0128] 2. 实验方法\n[0129] （1）分组与给药\n[0130] 将大鼠按体重大小排序、编号；用随机区组分组法随机分成6个组，A：假手术组（Sham），B：模型组（Model），C：WSXN 1高剂量组（80mg/kg），D：WSXN1低剂量组（40mg/kg），E：RSSW组（120mg/kg），H：阳性药物EGB761（40.0mg/kg），每组10只。\n[0131] （2）实验安排\n[0132] 假手术组和模型组大鼠在造模前5天、术后14天每天1% CMC-Na灌胃1次，手术当天术前2小时灌胃1次。其余药物组分别按各自的剂量在造模前5天、术后14天每天灌胃给药，手术当天术前2小时灌胃1次。在术后2天、5天、8天和12天称体重后，进行体重变化率评价。（体重变化率＝(B－A)/A×100%，A:第一天体重，B:当天体重）。术后每天观察大鼠行为，第8天让大鼠自由游泳2分钟以适应周围环境，第9天开始进行Morris水迷宫测试，历时6天，测试期间照常给药。术后第15天处死动物，每组随机选择5只大鼠取全脑保存于4%多聚甲醛中，用于做脑切片进行整片的HE染色观察各组的脑缺血损伤程度；\n并且进行大脑海马尼氏染色观察各组的CA1区锥体细胞的损伤程度。\n[0133] （3）改良Pulsinelli 四血管阻断法制造VD大鼠模型\n[0134] 大鼠腹腔麻醉后，行背侧颈正中切口，逐层钝性分离，暴露双侧第1颈椎横突翼小孔，用直径约0.15mm的电凝针灼烧双侧翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞，再将大鼠仰卧固定，行腹侧颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，以4号丝线穿线备用。24h后，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉15min，局部伤口缝合前，以磺胺粉局部喷洒处理防止感染，术后3天给予青霉素2U /kg肌肉注射抗感染。假手术组步骤同上，不做缺血处理。\n[0135] 评价造模成功的标准：夹闭双侧颈总动脉10s左右，大鼠出现意识丧失、双侧瞳孔扩大、角膜反射和翻正反射消失，并在15min缺血期内意识和上述反射均未恢复者，表示造模成功，方可实施再灌注。在缺血期死亡或仅出现昏睡以及在整个过程中出现抽搐的大鼠均被废弃。\n[0136] （4）Morris水迷宫实验\n[0137] 定向航行实验(Place navigation test)：\n[0138] 该实验用于测试动物的学习记忆能力。在手术后第8天让大鼠自由游泳2分钟以适应周围环境，从第9天开始进行Morris水迷宫测试，每只大鼠每天训练3次，即每天训练\n3个入水点，每次间隔2~3小时，实验历时5天。训练时随机选择入水点，将大鼠面向侧壁放入水中，待大鼠找到平台之后，让其在平台上停留10秒，观察并记录大鼠寻找平台时间（Latency of the rats to reach the platform，潜伏时间）。以寻找平台时间即潜伏期作为检测学习记忆的指标。训练时，如果大鼠在90秒内未找到平台，需用手将其引至平台，这时潜伏期记为90秒，连续5天。\n[0139] 空间探索实验( Spatial probe test)：\n[0140] 手术后第14天后进行空间探索实验。撤除平台，从离目标象限最远的一个入水点将大鼠面向侧壁放入水中，记录大鼠90秒内在目标象限正对的象限中的探索路程和穿越平台次数以观察记忆能力。\n[0141] （5）数据处理\n[0142] 实验数据用mean±SEM表示，用SPSS 13.0软件重复测量数据的方差分析进行差异显著性检验。\n[0143] 3. 实验结果\n[0144] （1）对大鼠体重变化率的影响：\n[0145] 如图3所示，假手术组术后体重呈增长趋势，模型组由于全脑缺血引起的损伤，造成体重增长慢甚至有体重下降现象。（各时间点与给药前比较）体重变化率，与假手术组同时间点比较，模型组造模后2天、5天、8天和12天均有显著性差异。同时间点体重变化率与模型组相比，WSXN1高剂量组在术后5天、8天和12天有显著性差异；阳性对照组在术后\n8天和12天有显著性差异，表明给予这些药物可改善脑缺血引起的体重下降。\n[0146] （2）对脑组织缺血损伤的影响\n[0147] 正常大鼠脑海马组织光学显微镜下组织形态：低倍镜下，假手术组大鼠脑海马组织显“C”形，分为CA1、CA2、CA3区，CA1区有3~4层锥体细胞，排列整齐（图4、图5）；高倍镜下，锥体细胞核大而圆，有1~2个核仁，锥体细胞密度为172.1±17.4（表10）。\n[0148] 大鼠经Pulsinelli四血管阻断、前脑缺血模型成功的大鼠立即出现意识消失、翻正反射消失和瞳孔扩大。前脑缺血再灌注7天，可见动物整体状况不佳，大鼠外观活动明显减少，皮毛耸耸，不光滑，体重减轻；大鼠脑组织细胞明显损伤、海CA1区锥体细胞已大部分死亡，细胞碎片散乱分布（表10）。\n[0149] 给予不同剂量的乌参醒脑方（WSXN1）、人参首乌提取物（RSSW）和银杏提取物片（EGB761），动物整体状况改善，大鼠外观活动正常，皮毛光滑，体重减轻不明显；缺血再灌注后动物存活数比模型对照组明显多；与模型组比较，CA1区活锥体细胞密度显著增加，不少CA1区细胞形态正常、大鼠脑海马组织细胞形态得到明显改善。低、高剂量乌参醒脑方组活锥体细胞密度比模型组明显增加，且显一定剂量依赖性（P＜0.01，见表10和图4、图5 WSXN1）。实验表明乌参醒脑方和人参首乌提取物（RSSW）对急性前脑缺血再灌注所致大鼠脑海马CA1区神经元损伤和整体大鼠损伤有明显保护作用。\n[0150] 阳性对照药银杏提取物片40.0mg/kg组的大鼠脑海马CA1区锥体神经细胞密度也比模型组明显增加（P＜0.05，表10、图5 EGB761组）。提示银杏提取物片对缺血再灌注所致大鼠脑海马组织细胞损伤也有明显保护作用。\n[0151] 从抗脑缺血损伤药效学研究结果看，乌参醒脑方的药效好于同类产品国际标杆药物德国威玛舒培博士药厂进口的银杏叶提取物片（金纳多片EGB761）和复方人参首乌。\n[0152] 表10 乌参醒脑方等对前脑缺血再灌注损伤大鼠海马CA1锥体神经细胞的保护作用\n[0153] \n[0154] 注：与正常对照组比较 **P＜0.01；与模型组比较:★★P＜0.01。\n[0155] （3）对学习记忆的影响\n[0156] 通过定向航行实验，选取最重要的指标寻找平台时间即潜伏时间进行分析，检测了药物对全脑缺血大鼠学习记忆能力损伤的保护作用。结果见图6，模型组较假手术组的潜伏时间显著延长，表明全脑缺血导致学习记忆能力的下降。而WSXN1高、低剂量组，RSSW组和阳性对照组EGB的潜伏期均比模型组缩短，其中高低剂量WSXN1最显著，说明高、低剂量WSXN1对脑缺血诱导的学习记忆损伤最具保护作用。\n[0157] 全脑缺血大鼠空间探索实验，选取重要的指标穿越平台次数和在目标象限探索路程进行分析。结果如图7所示。\n[0158] 结果显示各组大鼠90秒内穿越平台次数（即穿越原平台所在位置）模型组较假手术组显著下降，而低、高剂量WSXN1一定程度地增加脑缺血大鼠穿越平台次数，表明高、低剂量WSXN1对全脑缺血导致的空间记忆损伤可能存在保护作用。同时，如图7所示，与假手术组相比，模型组大鼠90秒内在原平台所在象限（即目的象限）的探索路程显著性缩短，说明全脑缺血导致大鼠的空间记忆力能力的显著下降，除了阳性对照药以外，各给药组均显示改善全脑缺血大鼠空间记忆能力的趋势，其中WSXN1高、低剂量组大鼠在目的象限的探索路程显著性缩短，具有统计学差异，表明高、低剂量WSXN1对全脑缺血导致的空间记忆损伤有显著的保护作用。\n[0159] Morris水迷宫结果显示各组的游泳速度无统计学差异，表明Morris水迷宫各观察指标的差异主要由学习记忆和空间记忆能力决定。定向航行实验表明，全脑缺血导致学习记忆能力的下降，而WSXN 1高、低剂量组，RSSW组和阳性对照组EGB761的潜伏期均比模型组缩短，其中低剂量WSXN1对脑缺血诱导的学习记忆损伤最具保护作用。同时，空间探索实验表明，全脑缺血导致大鼠的空间记忆力能力下降，WSXN 1高、低剂量组大鼠在目的象限的探索路程显著性缩短，其中高、低剂量WSXN1对脑缺血诱导的学习记忆损伤最具保护作用。同时，空间探索实验表明，全脑缺血导致大鼠的空间记忆力能力下降，WSXN 1高、低剂量组大鼠在目的象限的探索路程显著性缩短，表明WSXN1对全脑缺血导致的空间记忆损伤有显著的保护作用。\n[0160] 从抗脑缺血损伤、防治中风和血管痴呆药效学研究结果看，乌参醒脑方的药效好于同类产品国际标杆药物德国威玛舒培博士药厂进口的银杏叶提取物片（金纳多EGB761）和复方人参首乌。\n[0161] 实施例12 乌参醒脑方对脑缺血神经再生的影响\n[0162] （1）实验材料\n[0163] 10周龄SD大鼠，雄性，250~350g，由广东省医学实验动物中心提供；银杏提取物片（金纳多 EGB761，德国威玛舒培博士药厂生产）；人参首乌提取物（RSSW），乌参醒脑方提取物（WSXN2）均由本实验室提供。5- bromodeox yuridine ( BrdU，sigma 公司)；小鼠抗BrdU 单克隆抗体(CST公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG( H+ L)，山羊抗小鼠Cy 5，抗荧光淬灭封片液，DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒( 碧云天生物技术研究所, 江苏海门) 。\n[0164] 主要仪器：CO2孵箱（美国Heraeus HERAcell 150）；倒置荧光显微镜（德国ZEISS AXIO OBSERVER A1）；石蜡标本包埋机（德国Leica-2000 型）；石蜡标本切片机（德国Leica-2135 型）；自动显微摄影系统和彩色细胞图像分析仪（德国AxioVision Rel. 4.7）；\n显微镜（日本Olympus BX-51 型）；共聚焦激光扫描显微镜摄像（日本Olympus LSM-GB200）。\n[0165] （2）实验方法\n[0166] 大鼠随机分为假手术组( SH)、缺血模型组( Mo)、EGB 761金纳多银杏提取物片(EGB 761，40 mg/ kg )、RSSW组(120 mg/ kg )、WSXN2高、低剂量组(WSXN2 80、40mg / kg)。给药组于脑缺血前预先给予各相应剂量药物 5 d。\n[0167] 大鼠用10%水合氯醛( 300 mg/ kg，ip) 麻醉，建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型（MCAO）2 h后进行再灌注，再灌注时间持续7 d。在再灌注24 h，各组大鼠进行行为学评分。采用5分制行为学评分标准：行为正常为0分，右前爪不能完全伸展为1分，自发转圈或向右侧行进为2分，仅在受到刺激时行进为3分，对刺激无反应为4分。以评分在1~3之间的大鼠为实验对象。\n[0168] 给药组大鼠于脑缺血再灌注前5 d 开始按分组剂量给予各种药物；末次给药24 h后，大鼠i. p. BrdU ( 100 mg/kg，连续3d，间隔24h)。最后1次注射BrdU后6h处死大鼠。立即分离海马行BrdU单标免疫组化反应。\n[0169] 神经再生的荧光标记：组织切片在含BrdU ( 10 mo l/ L)的溶液中加热( 85℃，\n5 min)，2 mol/ L HCl中孵育( RT，30min)，0.1 mol/ L硼酸( pH 8.5)中漂洗10min，含\n1% H2O2的PBS中孵育30 min，PBS(含3%正常山羊血清，0.3% ( w/v ) Triton X 100和0. \n1%BSA)中封闭1 h(室温)，接着用小鼠抗BrdU单克隆抗体( 1：200)孵育( 4 ℃过夜)。\n用山羊抗小鼠Cy5( 1：1000)孵育，漂洗，晾干，用荧光封片剂包埋，对照组组织切片处理省去一抗血清。每只动物取5张切片进行共聚焦激光扫描显微镜摄像并分析，实验结果见图\n8（SH为假缺血对照组；Mo为缺血组；EGB761为银杏提取物组；RSSW为人参首乌提取物组；\nWSXN为乌参醒脑方提取物。图中小点示实验大鼠海马区再生神经元数量）。\n[0170] 数据分析结果表明，模型组大鼠在脑缺血再灌注后24 h 出现了明显的行为学异常( 与对照组比，P<0.01)，各给药组大鼠的行为学评分均低于模型组(与模型组比，P<0.01)，WSXN2高剂量组显著低于EGB 761和RSSW组(P<0.01)，见表11。\n[0171] 表11 药物对脑缺血再灌注24 h大鼠后海马神经行为评分的影响(X±SD, n= 6)[0172] \n \n# # #\n[0173] 注：与假手术组比较，P<0. 05， P<0. 01；与模型组比较，*P< 0. 05, **P<0. \n01。\n§§ ※※\n[0174] 与EGB761比较， P<0. 01；与RSSW组比较， P<0. 01。\n[0175] 为了确定脑缺血再灌注后海马神经的再生情况，采用激光共聚焦显微镜分析了各+\n组大鼠的海马神经(图8)。结果表明，模型组大鼠海马区BrdU 细胞数明显增加(与对照+\n组比，P<0. 01)； EGb761组、RSSW组和WSXN2组大鼠海马区BrdU 细胞数增加更显著( 与+\n模型组比，P<0. 01)。其中，WSXN2高剂量组对大鼠海马区BrdU 细胞增加最显著，增加值显著好于其它给药组。见表12，图8。\n[0176] 表12 大鼠脑缺血再灌注后海马神经的再生(X±SD, n= 6)\n[0177] \n[0178] 注：与假手术组比较，#P<0. 05，# #P<0. 01；与模型组比较，*P< 0. 05, **P<0. \n01。\n[0179] 实施例13 乌参醒脑方对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)所致小鼠海马神经元损伤的保护作用\n[0180] 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD) 是老年人常见的中枢神经系统退行性疾病。β-淀粉样蛋白在AD发病中起重要作用，本发明用β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)所致小鼠海马神经元损伤的诱导AD模型。研究乌参醒脑方、人参首乌提取物和银杏叶提取物对此模型AD的防治药效。\n[0181] 1. 实验动物：健康雌性C57BL/ 6 小鼠40 只, 体质量( 20±2) g , 由广东省实验动物中心提供。将其置于(25±2.0)℃室温下，12~12h昼夜循环光照, 自由进食、饮水。实验前动物适应实验室环境1周。\n[0182] 2. 药品及试剂：WSXN1、RSSW、EGB761由广东药学院中医药研究院提供；Aβ25-35购自美国Sigma 公司; 逆转录试剂盒购自美国Promeg a 公司。Tag DNA 聚合酶购自日本T AKARA公司。其余试剂均为国产分析纯。\n[0183] 3. 凝聚态Aβ25-35的制备：将1 mg Aβ25-35 溶于1 mL 灭菌生理盐水中, 浓度为\n1 mmol/ L。密封后置于37℃ 细胞培养箱中孵育96 h, 使其变为凝聚态的Aβ25-35, 放在\n4℃冰箱中备用。\n[0184] 4. 小鼠AD模型的制备及给药\n[0185] C57BL/ 6小鼠经水合氯醛( 400 mg / kg ) 麻醉后, 切除双侧卵巢。手术10 d 后, 将小鼠随机分为对照组、Aβ25-35组、Aβ25-35+WSXN1组、Aβ25-35 + RSSW组及Aβ25-35+ EGB761组, 每组10只。对照组小鼠侧脑室注射生理盐水。其他组小鼠侧脑室注射1 mmol/L Aβ25-35 制备AD 小鼠模型。模型制备3d后，对照组与Aβ25-35组小鼠灌胃生理盐水5 mL/kg, Aβ25-35+WSXN1 组小鼠灌胃WSXN1(80 mg/kg )；Aβ25-35+ RSSW 组小鼠灌胃RSSW (120 mg/kg)；Aβ25-35+ EGB761组小鼠灌胃EGB761 (40mg/kg)。连续用药14d。\n[0186] 5. Morris水迷宫训练及测试\n[0187] 自给药第8天开始水迷宫训练，共7d。将特制水迷宫平台放于第4象限，每只小鼠每天检测2次，排除平台所在象限，在其他3个象限的中间贴壁放入小鼠。以小鼠上台10s不再下水认为一次测试完成；不能上台的小鼠记录满90s，并引导小鼠到平台，使其在平台上持续30 s，以强化记忆。摄下小鼠的游泳过程，共记录1周，此为小鼠的学习过程。学习过程结束后1周，撤去平台，测试小鼠的空间记忆能力(以小鼠在90 s内穿越平台所在位置的次数表示)。然后，经水合氯醛麻醉小鼠，取小鼠新鲜海马组织，储存于-80℃冰箱，用于基因检测。\n[0188] 6. 统计学分析：实验结果以 ±s表示，组间比较用SSPS13. 0 统计软件进行单因素方差分析( One-Way ANOVA)，并以Tukey 法进行两两比较。\n[0189] 7. 实验结果\n[0190] 表13 WSXN1等药物对Aβ25-35诱导的AD小鼠学习记忆能力和Bcl-2基因表达的影响\n[0191] \n[0192] 与对照组相比，F=11.3~19.61，q= 5. 848~9.186，** P< 0. 01；与Aβ25-35组相比，##\n# q= 5. 848~ 9.186，P< 0. 01。\n[0193] （1）WSXN1对Aβ25-35诱导的小鼠空间学习记忆能力的影响\n[0194] 训练至第7天时，Aβ25-35组的潜伏期比对照组明显延长( P< 0.01)；而WSXN1、 RSSW和 EGB761 给药组的潜伏期较Aβ25-35模型组明显缩短( P <0.01) ；训练结束1周后，撤掉平台，与对照组小鼠相比较，Aβ25-35组小鼠穿越平台的次数明显减少；而WSXN1、RSSW和EGB761灌胃给药可明显改善Aβ25-35组小鼠的记忆能力。详见表13。\n[0195] （2）WSXN1对Aβ25-35诱导的小鼠海马bcl-2基因表达的影响\n[0196] Aβ25-35侧脑室注射可明显降低小鼠海马组织中bcl-2基因的表达，而WSXN1、RSSW和EGB761灌胃给药可改善Aβ25-35的这种损伤作用，增加抗凋亡基因bcl-2 基因的表达，保护小鼠大脑神经元损伤。\n[0197] 上述结果提示：WSXN1、RSSW和EGB761对阿尔茨海默病( AD)有防治药效。乌参醒脑方的药效与人参首乌提取物和银杏叶提取物比较有一定的优越性。\n[0198] 实施例14 银杏叶提取物促进人参皂苷成分进入脑组织\n[0199] （1）实验材料\n[0200] 试药：乌参醒脑方（WSXN）和人参首乌提取物（RSSX）、人参皂苷提取物（ERS）、何首乌提取物（EHSW）、阳性对照银杏叶提取物（EGB761）由广东药学院中医药研究院提供，各试药应用1% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成混悬液灌胃。\n[0201] 人参皂苷Rg1、Re、Rb1 对照品: (购自中国药品生物制品检定所, 批号分别为\n110703 - 200424、110754 -200421、110704 - 200420)。\n[0202] 试剂：色谱纯甲醇、乙腈、磷酸、甲酸、无水乙醇、等均为德国进口。水为超纯水(蒸馏水再经过Millipore超纯水系统制备)。\n[0203] 仪器：美国AB公司AB I4000 Q TRAP三级四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源( ESI)；美国Agilent公司-1100液相色谱系统；美国Waters固相萃取仪，Waters Oasis HLB柱。\n[0204] 实验动物：雌雄各半、体重220~250g的Sprague-Dawley大鼠，清洁级标准，由南方医科大学实验动物中心提供（合格证号：粤检证字第2008A053号）。4只一笼。温度控制在\n25℃±1℃，灯光控制12小时光，12小时暗，自由饮水和食用动物饲料。饲养3天后开始实验。\n[0205] （2）试验方法\n[0206] 给药：大鼠随机分成WSXN、RSSW、ERS、EHSW和银杏叶提取物阳性对照（EGB761）和正常对照6组，每组6只，分别灌胃给药WSXN 120 mg/kg、RSSW 100mg/kg、ERS 50 mg/kg、EHSW 50 mg/kg、EGb761 20 mg/kg和生理盐水，按0.2mL /100g (体质量)的容量用溶媒调整药物浓度。其中WSXN、RSSW和ERS三者含有相同剂量15mg/kg的人参总皂苷；WSXN、RSSW和EHSW三者含有相同剂量10mg/kg的二苯乙烯苷，而WSXN和EGB761组含有等量EGB（银杏叶提取物）（12mg/kg）。分别于给药后0，30、60、120、240min股动脉取血约5mL，股动脉放血于肝素处理的试管中，离心取血浆。取血后即刻处死动物，分别取同侧大脑皮层，-20℃冰箱保存至分析。\n[0207] 其中，WSXN 120 mg/kg[相当于(人参总皂苷15mg+二苯乙烯苷10mg+EGB \n20mg)/kg]，RSSW 100mg/kg [相当于(人参总皂苷15mg +二苯乙烯苷10mg)/kg]，ERS 50 mg/kg(相当于人参总皂苷15mg /kg)，EHSW 50 mg/kg(相当于二苯乙烯苷10mg/kg)；EGB \n20 mg/kg和生理盐水。\n[0208] （3）药物浓度测定\n[0209] ①样品处理 \n[0210] 血浆：用Waters固相萃取仪，Waters Oasis HLB 柱依次用甲醇和水各2 mL活化，取血浆0.5 mL减压恒速通过SPE柱，然后用水2 mL清洗小柱，抽干；最后用甲醇2 mL洗脱，收集洗脱液，35 ℃水浴氮气流下吹干，残留物用流动相500 μL 充分溶解后，过0.45μm滤膜，取5μL进样，进行HPLC /MS/MS分析。\n[0211] 脑组织：大鼠相应组织0.1g左右，加1. 0mL超纯水，用高速组织粉碎机制成匀浆后，振荡5 min，18 000 r/min离心5 min，取上清0.5 mL减压恒速通过SPE柱，然后用水2 mL清洗小柱，抽干；最后用甲醇2 mL洗脱，收集洗脱液，35 ℃水浴氮气流下吹干，残留物用流动相500 μL充分溶解后，过0.45μm滤膜，取5μL进样，进行HPLC /MS/MS分析。\n[0212] ②分析条件\n[0213] 色谱条件：色谱柱为RESTEK PinnacleⅡC18柱 (50 mm ×211 mm，5 μm)；柱温：\n20℃；流速为200 μL/min；流动相为A水(体积分数0.5‰甲酸)，B乙腈(体积分数0.5‰甲酸)，梯度洗脱( 0～12 min，流动相B体积分数20%～50%；12～12.1min，流动相B体积分数50%～20%；12.1～21 min，流动相B体积分数20%)。\n[0214] 质谱条件：电喷雾ESI离子源，气帘气为10 psi，雾化气( GAS1 ) 为40 psi，加热辅助气( GAS2 ) 为40 psi，碰撞气CAD为Medium，喷雾电压IS为5.5 Kv，雾化温度为500 ℃，检测方式为正离子多离子反应检测(MRM)，用于定量分析的离子为 m / z Rg1 832.8 → \n643.6；Re 969.8 → 789.7；Rb1 1132.1 → 365.3。\n[0215] ③ HPLC法测定血浆和脑组织匀浆中二苯乙烯苷含量\n[0216] 采用C18色谱柱( 250 mm ×4.6 mm，5 μm )，以虎杖苷为内标，乙腈：甲醇：0. 1%冰醋酸( 12：10：78 )为流动相，检测波长320 nm，流速为1.0 mL/min。\n[0217] （4）结果与讨论\n[0218] 各组不同时间点的Rb1、Rg1和Re在大鼠脑组织中的浓度，见表14~17。\n[0219] 表14可见，WSXN组的不同时间点的Rb1在大鼠脑组织中的浓度比RSSW和ERS组显著升高，而正常对照和EGB组不同时间点的大鼠脑组织中未检出Rb1。说明EGB的存在能显著促进WSXN方中Rb1进入脑组织，有利于在脑组织中发挥药效作用。\n[0220] 表14 各组不同时间点的Rb1在大鼠脑组织中的浓度（ng/g， ±S）\n[0221] \n[0222] ★★与ERS组比较，P<0.01；##与RSSW组比较，P<0.01。\n[0223] 由表15可见，WSXN组不同时间点的Rg1在大鼠脑组织中的浓度比RSSW和ERS组显著升高，而正常对照和EGB组不同时间点的大鼠脑组织中未检出Rg1。说明EGB的存在能显著促进WSXN方中Rg1进入脑组织，有利于在脑组织中发挥药效作用。\n[0224] 表15 各组不同时间点的Rg1在大鼠脑组织中的浓度（ng/g， ±S）\n[0225] \n \n★★ ##\n[0226] 与ERS组比较，P<0.01；与RSSW组比较，P<0.01。\n[0227] 由表16可见，WSXN组不同时间点的Re在大鼠脑组织中的浓度比RSSW和ERS组显著升高，而正常对照和EGB组不同时间点的大鼠脑组织中未检出Re。说明EGB的存在能显著促进WSXN方中Re进入脑组织，有利于在脑组织中发挥药效作用。\n[0228] 表16 各组不同时间点的Re在大鼠脑组织中的浓度（ng/g， ±S）\n[0229] \n★★ ##\n[0230] 与ERS组比较，P<0.01；与RSSW组比较，P<0.01。\n[0231] 表17可见，WSXN组的不同时间点的二苯乙烯苷在大鼠脑组织中的浓度比RSSW组和EHSW组显著升高，而正常对照和EGB组不同时间点的大鼠脑组织中未检出二苯乙烯苷。\n说明EGB的存在能显著促进WSXN方中二苯乙烯苷进入脑组织，有利于在脑组织中发挥药效作用。\n[0232] 表17 不同时间点各组大鼠脑组织中二苯乙烯苷的浓度（ng/g， ±S）\n[0233] \n[0234] ★★与EGB组和EHSW组比较，P<0.01；##与RSSW组比较，P<0.01。\n[0235] 实施例15乌参醒脑方对血管性痴呆的影响\n[0236] （1）临床资料与方法\n[0237] 病例情况：全部病例均系神经科住院病人，男性70例，女性20例；年龄58~76岁，平均63.9岁；病程最短1年，最长10年，平均3.5年。经临床检查、神经量表测试，并经头颅CT或MR证实者。\n[0238] 诊断标准：采用DSM-IV中血管性痴呆的诊断标准。\n[0239] 诊断标准：采用DSM-IV中血管性痴呆的诊断标准。\n[0240] 排除标准：有严重神经、血液、内分泌等原发性疾病及海金斯基缺血指数量表（HIS），总分18分，得分＜7分为老年性痴呆者。 \n[0241] 量表选择：1美国简易智能量表，总分30分，若得分<16分者为智能障碍；2日本长谷川痴呆量表，总分30分，若得分<16分者为痴呆成立；3海金斯基缺血指数量表（HIS），总分18分，若得分>7分者为血管性痴呆，得分＜7分者为老年性痴呆。 \n[0242] 中医主要症状：参考中药新药临床研究指导原则；中药新药治疗老年期痴呆的临床研究指导原则。 \n[0243] 结合临床经验，将以下症状作为观察指标：神情呆滞，语言不利，或寡言少语或语言倒错，善忘，不寐，头晕，头痛，舌质瘀点。\n[0244] 疗效标准：采用综合评定法，以患者治疗前后的智能状态、中医主要症状、体征等方面的改变作为综评内容，并以智能改变为重点。痊愈者长谷川痴呆量表测试得分增加到正常值，显效者得分增加5分以上，有效者得分增加不足5分，无效者得分不但无增加反而下降。\n[0245] 用药方法：用WSXN处方制成滴丸（见实施例6），每天早中晚各服10粒，2个月为\n1疗程，均用药3个疗程，其间停用其它脑血管扩张药物、脑细胞代谢药物、神经功能调节药物。银杏叶提取物片（金纳多片）40mg*20片/盒，一天2-3次，每次1-2片。\n[0246] 人参首乌胶囊由贵阳医学院制药有限公司生产,每粒装0.3克, 口服，一次2粒，一日3次，饭前服用。\n[0247] （2）疗效与结果\n[0248] 治疗前后量表积分变化：（见表18、19、20、21）\n[0249] 表18 治疗前后简易智能量表积分变化( ±s)\n[0250] \n[0251] 表19 治疗前后长谷川痴呆量表积分变化(x±s) \n[0252] \n[0253] 中医主要症状变化：（见表20）\n[0254] 表20 治疗前后主要症状评分变化( ±s)\n[0255] \n[0256] 疗效分析：（见表21）\n[0257] 表21 二种药物对血管性痴呆疗效统计\n[0258] \n[0259] （3）结论\n[0260] WSXN滴丸对血管性痴呆的智能改善作用：从表21可以看到，60例病员经服WSXN滴丸和金纳多片3个疗程后，二药治疗的量表得分均明显增加(P<0.01)，说明都有恢复记忆力、改善智能作用。 本有效成分组合物WSXN对本病的总有效率为80.0%，尽管痊愈者为零、显效仅5例，但有效率却占大半多 (63.3%)。本有效成分组合物疗效比金纳多片稍好。\n[0261] （4）对老年性痴呆症的防治作用 \n[0262] 乌参醒脑滴丸和人参首乌胶囊的疗效分析:见表22\n[0263] 表22 两种药物对老年性痴呆疗效统计\n[0264] \n[0265] 从22表可以知道，乌参醒脑滴丸对老年性痴呆症的总有效率77.1%， 显效17.1%，比目前常用药的70%的总有效率略高，而没观察到明显副作用。\n[0266] 结论：本品对老年性痴呆的智能减退有改善作用，从表22可以看到，35例病员经服乌参醒脑方组合物2个疗程后，量表得分明显增加(P<0.01)，说明有恢复记忆力、改善智能作用，且语言不利、失眠、烦躁、易怒、舌质瘀点等症状改善非常明显，对痰浊阻窍，气滞血瘀的老年性痴呆（AD症）32例有效率达77.1%。疗效比口服服用人参首乌胶囊高，特别是但对失眠、烦躁、易怒等症状疗效更显著。\n[0267] 临床研究结果表明，本品具有显著的抗脑缺血损伤，改善学习记忆作用，治疗脑缺血损伤相关的中风后遗症和血管性痴呆及老年痴呆临床疗效确切。