吲哚衍生化合物以及包含它们的药物组合物

1.化合物，其选自下列化合物：
5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2H-异喹啉-1-酮；
5，8-二甲基-6-(3-甲氧基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉-1-酮；或
5，8-二甲基-6-(5-甲基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉。
2.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1所述的化合物和任选地药学上可接受的载体。
3.化合物在制备药物中的用途，其中所述化合物选自下列化合物：
6-氯-5，10-二甲基-11H-吡啶并[3’，2’：4，5]吡咯并[3，2-g]异喹啉；
5，10-二甲基-11H-吡啶并[3’，2’：4，5]吡咯并[3，2-g]异喹啉；
5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2H-异喹啉-1-酮；
5，8-二甲基-6-(3-甲氧基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉-1-酮；或
5，8-二甲基-6-(5-甲基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉；
所述药物用于治疗受试者体内由至少一种诱导早期终止密码子出现的突变引发的遗传疾病。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述遗传疾病选自β-地中海贫血、马方氏综合征、杜兴氏肌营养不良症、贝克尔氏肌营养不良症、乌利希氏病、胡尔勒氏综合征和囊性纤维化，以及其用于在涉及所述遗传疾病的基因中具有提前终止密码子的受试者。

吲哚衍生化合物以及包含它们的药物组合物\n[0001] 具有早期终止密码子的mRNA的降解方法(无义介导的mRNA降解，NMD)是定性控制的方法，在迄今为止的所有真核生物研究中得以确认(CONTI和IZAURRALDE，2005；\nMAQUAT，2004a)。这种机理的功用之一是降解具有提前终止密码子(PTC)的mRNA以阻止截短蛋白的合成，所述截短蛋白是无功能或其功能对细胞可能有害。此外，已确认在酵母、果蝇和哺乳动物的基因调控中涉及NMD路径(HE等人，2003；MENDELL等人，2002；REHWINKEL等人，2005；SUREAU等人，2001；WOLLERTON等人，2004)。 \n[0002] 在哺乳动物细胞中，NMD在前信使RNA的拼接之后发生，并在大部分情况下，通过位于外显子-外显子拼接(exon-exon junction)上游的20-24核苷酸的蛋白质复合物调节(Conti和Izaurralde，2005；Lejeune和Maquat，2005；Maquat，2004b)。推测被称为外显子拼接复合物EJC的该蛋白质复合物募集留存的UPF蛋白质，其在NMD中担当重要角色，迄今为止并未被表征。在“第一转换周期”(Ishigaki等人，2001)期间，识别到PTC，且目标mRNA通过5’向3’消化被降解，涉及帽(cap)以及外切核酸酶如hXRN1和hXRN2/hRAT1的除去，和通过3’向5’消化被降解，涉及脱腺苷酸化和胞外体(exosome)(Chen和Shyu，\n2003；Couttet和Grange，2004；Lejeune等人，2003)。 \n[0003] UPF1为磷蛋白，其在NMD过程中经历磷酸化/脱磷酸化循环(Ohnishi等人，2003；\nPage等人，1999；Pal等人，2001)。显示出UPF1与酵母中(Czaplinski等人，1998)和哺乳动物中(Kashima等人，2006)的转化终止因子相互作用，因此可为EJC和转化终止复合物之间的连接。最近在哺乳动物细胞(Hosoda等人，2005)中显示了hUPF1和帽结合蛋白质CBP80之间的直接相互作用，表明hUPF1在第一转化循环之前或其过程中建立复合物相互作用。\n显示hUPF1的磷酸化通过hSMG1进行，所述hSMG1为与PI3有关的激酶(Page等人，1999；\nPal等人，2001；Yamashita等人，2001)，并需要hUPF2和hUPF3(Kashima等人，2006) 的存在。与此相反，hUPF1的脱磷酸化需要多-蛋白质复合物的存在，所述多蛋白质由hSMG5、hSMG6、hSMG7和(PP)-2A磷酸酯酶蛋白质(Chiu等人，2003；Ohnishi等人，2003)组成。\nhSMG5和hSMG7蛋白质主要位于细胞质中，其部分存在于处理小体(processing bodies，P-小体)(Unterholzner和Izaurralde，2004)。hSMG6也是细胞质类蛋白质，其在某些细胞质集合体(cytoplasmic foci)富集，该某细胞质集合体似乎与P-小体不同，其性质仍然探索之中(Unterholzner和Izaurralde，2004)。 \n[0004] 已描述了P-小体在高级和低级真核细胞中(Cougot等人，2004；Sheth和Parker，\n2003)。在哺乳动物中，这些细胞质结构包含参与mRNA降解的多种因子，包括除去用于帽的机理的组分，如DCP1a(Ingelfinger等人，2002)、DCP2(Ingelfinger等人，2002；van Dijk等人，2002)、GE1(Yu等人，2005)也称作HEDLS(Fenger-Gron等人，2005)、p54/RCK(Cougot等人，2004)、去腺嘌呤酶CCR4(Cougot等人，2004)、XRN1(Bashkirov等人，1997)、参与涉及RNA方法的不同方面的LSM1-7复合物(Cougot等人，2004；Ingelfinger等人，2002)，和NMD机械的组分，其为hUPF 1、hSMG5和hSMG7(Fukuhara等人，2005；Unterholzner和Izaurralde，2004)。P-小体的功能仍不确定，但它们可用作非-转化的mRNA和参与mRNA降解(Brengues等人，2005；Pillai等人，2005；Teixeira等人，2005)和/或位于RNA降解点(Cougot等人，2004；Sheth和Parker，2006)的蛋白质的储藏室。 \n[0005] 如今，将近三分之一的人类遗传疾病源自早期终止密码子(Frischmeyer和Dietz，1999；Kuzmiak和Maquat，2006)的出现。在许多情况下，通过NMD机理，终止密码子引起带有其的mRNA降解。结果是相关基因不表达，并且当所涉及的突变将允许功能截短蛋白转化时依然如此。通过抑制感染该病变的病人体内的NMD机理，可能恢复功能截短蛋白的表达，这是关注的方向。 \n[0006] 发明人已表明特定的吲哚衍生物能特定地在体外和在体内抑制NMD，所述化合物使得感染杜兴氏肌营养不良症(DMD)的病人细胞系中带有提前终止密码子的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的mRNA表达水平上升。 \n[0007] 相应地，本发明的第一目的涉及对应于下列通式II的衍生自吲哚 的化合物，所述化合物药学上可接受的盐、它们的异构体和/或其混合物： \n[0008] 通式II \n[0009] 其中： \n+\n[0010] ●X代表N、CR8或脱水基质NR8， \n[0011] ●其中R8代表氢原子、任选地被苯基取代的羟基或烷基或甲氧基，优选R8代表氢原子， \n[0012] ●R2、R3和R4独立地代表氢原子或卤原子或任选地被取代的烷基、胺、烯烃、酯、氨磺酰、醚基团，如甲氧基或三氟甲氧基，或苄基， \n[0013] ●R5代表氢原子或任选地被取代的饱和或不饱和的烷基、胺、苄基， [0014] ●R6代表任选地被取代的C1-C3烷基，优选甲基或乙基，且更优选R6代表甲基， [0015] ●R7代表氢原子或任选地被取代的C1-C3烷基，当环A在b位置时不存在R7，和 [0016] ●R9和R10一起代表碳键或独立地代表R11、OR11、SR11、NR11R12基团， [0017] 其中R11和R12独立地代表氢原子、氧原子、任选地被取代的饱和或不饱和的C1-C3烷基，其可包含一个或多个硫、氧或氮原子。优选当R11和/或R12代表被取代的烷基时，该烷基被卤素，优选氟取代。 \n[0018] ●A代表环，当A在a或b位置时，对应于 \n[0019] \n[0020] \n[0021] 其中： \n[0022] R1代表氢、氧或卤原子，或任选地被取代的、直链或支链的和/或不饱和的烷基或胺基团，和 \n[0023] Z代表R1基团； \n[0024] 涉及所述化合物的药学上可接受的盐，它们的异构体和/或其混合物。 [0025] “卤原子”表示F、Cl、Br和I，和更特别地为Cl。 \n[0026] “不饱和的烷基”表示具有至少一个双键的烷基。 \n+\n[0027] 有利地X代表N或脱水基质NR8。 \n+\n[0028] 在当X代表脱水基质NR8和当R5代表氢的情况下，在下述两种形式之间存在平衡： \n[0029] \n[0030] 有利地，R2、R3和R4各自独立地代表氢原子或卤原子或任选地被取代的烷基、胺、烯烃或苄基。 \n[0031] 还有利地，R2、R3和R4各自独立地代表氢原子或卤原子或C1-C4烷基，和优选R2、R3和R4代表氢原子。 \n[0032] 优选R2、R3和/或R4各自独立地代表选自F，Cl，Br或I的卤原子，优选所述卤原子为Cl原子。 \n[0033] 有利地，R5代表氢原子或饱和或不饱和的烷基，如甲基、乙基、丙基或丁基，和更优选R5代表氢原子。 \n[0034] 有利地，R7代表甲基或乙基，和更优选R7代表甲基。 \n[0035] 有利地，R1为氢、氧或卤原子。 \n[0036] 有利地，R9和R10各自独立地代表氢原子、R11、OR11或SR11基团。 [0037] 在第一特定具体实施方式中，当R9代表不为氢原子的基团时，则 R10代表氢原子。 \n[0038] 有利地，R9代表OR11基团，其中R11代表氢原子、任选地被取代的饱和或不饱和的C1-C3烷基(其可包含一个或多个硫、氧或氮原子)，优选甲基。 \n[0039] 优选，通式I的化合物符合下述通式： \n[0040] \n[0041] 在第二特定具体实施方式中，当R10代表不为氢原子的基团时，则R9代表氢原子。 [0042] 有利地，R9和R10均代表氢原子。通式II的化合物则符合下述通式Ia： [0043] 通式Ia \n[0044] 其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、X和环A如之前所定义。 \n[0045] 优选的通式Ia的化合物为5，8-二甲基-6(5-甲基-吡啶-2-基胺)-异喹啉。 [0046] 通式Ia的另一优选的化合物为5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2H-异喹啉-1-酮。 \n+\n[0047] 优选，R9和R10代表氢，X代表N或脱水基质NR8。 \n[0048] 在第三特定具体实施方式中，R9和R10一起代表碳键，则通式II的化合物符合下述通式Ib： \n[0049] 通式Ib \n[0050] 其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、X和环A如之前所定义。 \n[0051] 还有利地，环A在a位置。 \n[0052] 在第四特定具体实施方式中，环A代表 \n[0053] \n[0054] 其中R1代表氢、氧或卤原子，或任选地被取代的、直链或支链的和/或不饱和的烷基或胺基团。 \n[0055] 当环A具有下列通式时： \n[0056] \n[0057] 其可无差别地代表基团 \n[0058] \n[0059] 其中R13代表氢原子或任选地被取代的C1-C4烷基，且R1如之前所定义。 [0060] 有利地，环A代表基团： \n[0061] \n[0062] 其中R1代表氧原子，胺基团或任选地被取代的、直链或支链的和/或不饱和的烷基，且R13代表任选地被取代的C1-C4烷基。 \n[0063] 还有利地，环A代表基团： \n[0064] \n[0065] 其中R1代表氢、氧或卤原子，或任选地被取代的、直链或支链的和/或不饱和的烷基或胺基团，优选氢原子或卤素，优选氯原子。 \n[0066] 在另一优选的具体实施方式中，A选自： \n[0067] \n[0068] 在根据本发明所述的具体实施方式中，通式II的衍生自吲哚的化合物符合下列通式I： \n[0069] \n[0070] 通式I \n[0071] 其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、X和环A如之前所定义； \n[0072] X、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和环A如之前所定义。 \n[0073] 通过通式I，设计了下述通式的化合物： \n[0074] \n[0075] 根据另一优选的具体实施方式，衍生自吲哚的化合物选自： \n[0076] ●6-氯-5，10-二甲基-11H-吡啶并[3’，2’：4，5]吡咯并[3，2-g]异喹啉(化合物70)； \n[0077] ●5，10-二甲基-11H-吡啶并[3’，2’：4，5]吡咯并[3，2-g]异喹啉(化合物71)； [0078] ●5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2H-异喹啉-1-酮；(化合物72)； [0079] ●5，8-二甲基-6-(3-甲氧基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉-1-酮(化合物497)；\n和 \n[0080] ●5，8-二甲基-6(5-甲基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉(化合物500)。 \n[0081] 优选，衍生自吲哚的化合物选自5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2H-异喹啉-1-酮、5，8-二甲基-6-(3-甲氧基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉-1-酮或5，8-二甲基-6(5-甲基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉。 \n[0082] 有利地，衍生自吲哚的化合物为5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2H-异喹啉-1-酮。 \n[0083] 本发明的另一目的在于包含至少一种之前所述的吲哚衍生物和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。 \n[0084] 作为药学上可接受的载体的例子，组合物可包含乳液、微乳液、水包油乳液、无水类脂和油包水乳液，或其他类型的乳液。 \n[0085] 根据本发明所述的组合物可进一步包含一种或多种添加剂，如稀释剂、赋形剂、稳定剂和防腐剂。这些添加剂为本领域技术人员所公知，特别描述于“Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，6thEd.”( 不 同 编 辑，1989-1998，Marcel Dekker)；和“PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems”(ANSEL等人，\n1994，WILLIAMS&WILKINS)中。 \n[0086] 第三目的在于至少一种如前所述的吲哚衍生物在制备治疗受试者遗传疾病的药物中的用途，所述遗传疾病由至少一种诱导早期终止密码子出现的突变引发。 [0087] 如在本发明所用的术语“受试者”对应于哺乳动物如啮齿动物、猫科动物、犬科动物、灵长类的动物或人类，优选所述受试者是人类。 \n[0088] 由至少一种诱导早期终止密码子出现的突变引发的这类遗传疾病是众所周知的，并占据了现今遗传疾病的近三分之一。可提及的这类遗传疾病的例子有：β-地中海贫血、马方氏综合征、杜兴氏肌营养不良症(DMD)、贝克尔氏肌营养不良症(DMD)、乌利希氏病(Ullrich’sdisease)、胡尔勒氏综合征或囊性纤维化(CF)，其更为人所知的名称是粘稠物阻塞症，和在所述遗传疾病中，受试者在涉及的基因中具有提前终止密码子。 [0089] 优选，使用所述突变毕竟可得到功能截短蛋白。 \n[0090] 根据本发明所述的化合物实际具有抑制NMD机理和使得具有提前终止密码子的mRNA转化的能力。 \n[0091] 功能蛋白质是指允许野生表型(wild phenotype)恢复的蛋白质。 \n[0092] 有利地，“功能蛋白质”是指相对于野生蛋白质具有足够的活性，以提供与野生蛋白质相同的功能并允许得到野生表型的蛋白质。 \n[0093] 本发明的第四目的在于治疗受试者由至少一种诱导早期终止密码子出现的突变引发的遗传疾病的方法，该方法包含给予治疗有效量的如前所述的药物组合物。 [0094] “治疗有效量”是指可诱导NMD的抑制的量。本领域技术人员以其普通常识或通过实施例中所描述的方法将能够决定所述治疗有效量。 \n[0095] 化合物可使用任何给药模式给药，例如通过肌内、静脉内、口服途径等等。 [0096] 提供下述实施例用作解释说明，并不限制本发明的范围。 \n实施例：\n[0097] I-材料和方法 \n[0098] I-1吲哚化合物\n[0099] 所有使用的多环吲哚化合物以20mg/mL悬浮在DMSO中，然后在10％(v/v)DMSO中制备为5mM的稀释液。 \n[0100] 测试的化合物如下表I所示： \n[0101] 表I \n[0102] \n[0103] \n[0104] \n[0105] I-3根据本发明所述的化合物的合成\n[0106] 化合物17、35和39的合成如下述公开所述：RIVALLE等人，J.Med.Chem.1983，26，\n181-185。 \n[0107] 通过与化合物17、35和39相同的步骤，从公开中描述的化合物8a和烯丙基胺得到化合物81。 \n[0108] 化合物67、70和71的合成描述于RIVALLE等人，Tetrahedron1981；37，2097-2103中。 \n[0109] 化合 物13、15和37的合 成描 述于BISAGNI等 人，Heterocycles1988，27，\n1671-1678中。 \n[0110] 化合物29通过下列合成方法得到：将在RIVALLE等人，(J.Med.Chem.1983，26，\n181-185)的公开中描述的化合物1a悬浮在DMF中。过量加入碘甲烷(10当量)。将反应介质加热至80℃持续1h，然后冷却至室温。加入2M Na2CO3溶液，并将反应介质带至80℃持续18小时。用二氯甲烷萃取产物。 \n[0111] 化合物72、497和500通过下列合成方法得到：在2mol％的Pd(Oac)2、3.5mol％的\n4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)和2.4当量的Cs2CO3存在下，将合适的溴吡啶(1当量)和胺(1当量)置于叔丁醇中。将反应介质带至90℃持续48小时，然后在硅藻土上过滤，再然后在硅胶柱(CH2Cl2/EtOH95∶5)上纯化。 \n[0112] 为了合成化合物72，使用2-溴吡啶(bromopridine)和6-氨基-5，8-二甲基-2H-异喹啉-1-酮(作为胺)。该胺描述于DUCROCQ等人，(Tetrahedron 1979，35，142)中。 \n[0113] 为了合成化合物497，使用2-溴-3-甲氧基吡啶和6-氨基-5，8-二甲基-2H-异喹啉-1-酮(作为胺)。 \n[0114] 为了合成化合物500，使用2-溴-5-甲基吡啶和5，8-二甲基-异喹啉-6-基胺(作为胺)。该胺描述于BALKAN等人，(Australian Journal ofChemistry，1969，22，2489)中。 \n[0115] I-3构建体\n[0116] 使用正义引物(sense primer)5’GCAACCTCAAGCTTACACCATGGTGCACCTGAC3’(SEQ ID NO：1)和反义引物(antisense primer )5’AGAAAGCAGATCTGCTTAGTGATACTTGTG3’(SEQ ID NO：2)，通过β-珠蛋白WT和NS39的PCR扩增(Thermann等人，1998)得到构建体β-珠蛋白Norm和Ter。在包含24个MS2位的改性的质体pRSVbgal(Fusco等人，2003)的HindIII/BglII位置克隆被扩增的片段。 \n[0117] I-4使用RT-PCR的NMD测量\n[0118] 在60mm碟中，在DMEM培养基(Dulbecco’sMedified EagleMedium，GIBCO-BRL)，补充37℃的10％(v/v)胎牛血清和5％CO2中使HeLa细胞生长。然后根据制造商的说明书使用LIPOFECTAMINE PLUSREAGENT(INVITROGEN)试剂盒，用3μg测试质体pmCMV-G1(Norm或39Ter)(Sun等人，1998)或3μg pf测试质体pmCMV-GPx1(Norm或46Ter)(Moriarty等\n6\n人，1998)和1μg参比质体phCMV-MUP(Belgrader和Maquat，1994)转染细胞(1×10)。\n转染后24小时，用5μM待测试的每种化合物处理细胞20小时，或用0.01％(v/v)DMSO处理作为对照。根据制造商的说明书使用TRI试剂(SIGMA-ALDRICH)纯化整个RNA，然后在\n32\nP-放射性标记的dCTP核苷酸存在下、在PCR扩增之前进行mRNA G1、GPx1和MUP的逆转录。\nPCR条件和分析方法如前所述(Ishigaki等人，2001)。PCR产物在Typhoon 9200(Amersham Biosciences)上定量。 \n[0119] I-5翻译效率的测试\n[0120] 用2μg质体pFluc和1μg质体pRluc转染HeLa细胞。转染后24小时，在收获细胞前，在0.01％(v/v)DMSO或待测试的不同化合物(5μM) 存在下培养细胞20小时，或在100μg/mL环己酰亚胺存在下培养细胞4小时。根据制造商的说明书使用Dual Glo荧\n5\n光素酶试剂盒(Promega)，在2×10 细胞当量上于microLumat LB 96P(EG&G Berthold)定量荧光素酶活性。然后针对Fluc和Rluc mRNA水平对荧光素酶活性归一化。 \n[0121] I-6在NMD抑制化合物存在下，用于测量siRNA降解路线整体性的荧光素酶活性[0122] 在6-孔板中使细胞生长，并使用具有50ng RLperfect报告RNA(Pillai等人，\n2005)、200ng为‘萤火虫荧光素酶’编码的pG 13质体和4μg pTzU6质体的Lipofectamine Plus Reagent(Invitrogen)试剂盒转染。转染后24小时，将待测试的化合物加入对应的孔。转染后48小时，根据制造商的说明书用Dual Glo荧光素酶试剂盒(Promega)测量荧光素酶活性。 \n[0123] I-7通过2D凝胶分析测量FLAG-hUPF 1的磷酸化水平\n[0124] 根据制造商的说明书使用Lipofectamine PlusReagent(Invitrogen)试剂盒用\n6\n1μg的pFLAG-hUpf1质体(Sun等人，1998)转染293T细胞(10)。12小时后，从培养基中移除血清持续24小时，然后加入5μM待测试的化合物，或作为对照，在37℃和5％CO2移除10％(v/v)DMSO持续3小时。然后在37℃和5％CO2再加入10％血清持续1小时。用裂解缓冲液纯化全部蛋白质，所述裂解缓冲液包含8M尿素、2％CHAPS和40mM的Tris碱。\n根据AMERSHAM-BIOSCIENCES为2D电泳描述的程序，用固定的pH梯度进行一维迁移。使用TM\nImmobiline DryStrip在pH3-10(18cm)来根据其等电点分离蛋白质。然后，二维通过将一维负载在10％SDS-PAGE凝胶上来进行。最后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，之后在\n4℃用含0.05％吐温的TBS中的抗-FLAG抗体(SIGMA-ALDRICH)培养它们过夜，然后用结合至过氧化物酶(PIERCE)的抗-小鼠山羊抗体培养。然后通过使用“SuperSignal West FemtoMaximum Sensitivity Substrate”(PIERCE)检测蛋白质。 \n[0125] I-8阻止NMD的步骤的测定\n[0126] 该实验如前所述进行(Hosoda等人，2005)。 \n[0127] I-9免疫荧光法，图像分析下的FISH测试\n[0128] 在10％(v/v)FBS DMEM中在12mm载玻片上生长HeLa细胞。将细胞(105)用500ng质 体pGFP-GE1(Yu 等 人，2005)、pYFP-hSmg5、pYFP-hSmg6、YFP-hSmg7(Unterholzner 和Izaurralde，2004)、pGFP-CCR4、pCFP-DCP1a(Cougot等人，2004)、pCI-neo-FLAG-hUpf1(Sun等 人，1998)、pcDNA3-hUpf3a-FLAG、pcDNA3-hUpf3b-FLAG(Lykke-Andersen等 人，2000)、pmCMV-G1(Norm或39Ter)(Sun等人，1998)或pmCMV-GPx1(Norm或46Ter)(Moriarty等人，\n1998)瞬时转染。转染后24小时，用5μM待测试的化合物或作为对照的0.001％(v/v)DMSO处理细胞。20小时后，在室温下使用福尔马林(formaline)溶液(SIGMA-ALDRICH)固定(fix)细胞10分钟，并在4℃用70％乙醇溶液透化过夜。 \n[0129] 为免疫荧光法测试，在室温下用抗-FLAG小鼠抗体(SIGMA-ALDRICH)培养固定细胞2小时，在PBS中洗涤三次，并在室温下用与Cy3或FITC(JACKSON IMMUNORESEARCH)结合的小鼠抗体培养1小时。最后，在室温下烟酸己可碱(2μg/μL)(SIGMA-ALDRICH)中培养2分钟之前，在PBS中洗涤细胞三次。 \n[0130] 对于FISH实验，37℃在组织培养培养箱中，在预杂交缓冲液(tRNA 125μg/mL，青鱼DNA 500μg/mL，BSA 1mg/mL，葡聚糖硫酸酯0.1g/mL，50％甲酰胺，2X SSC缓冲液)中培养固定细胞1小时。然后，在组织培养培养箱中，用杂交缓冲液(具有Cy3标记的探针的预杂交缓冲液)培养固定细胞过夜，37℃在SSC2X缓冲液中洗涤三次，在室温下1X SSC缓冲液中洗涤三次，最后，在室温下用烟酸己可碱(2ng/μL)(SIGMA-ALDRICH)培养2分钟。使用在5’和3’端以Cy3标记的探针5’CGATCTGCGTTCTACGGTGGT3’(SEQ ID NO：3)来检测G1Ter或GPX1Ter mRNA。 \n[0131] 用DMRA显微镜(Leica)、具有A4滤光器(对烟酸己可碱)，GFP和Y3滤光器(对Cy3)的油物镜PL APO 63x(NA 1.32)观察固定细胞。 \n[0132] I-10免疫纯化和蛋白质印迹分析\n[0133] 根据之前描述的程序(Lejeune和Maquat，2004)使用抗-hUPF1抗体(Ohnishi等人，2003)进行hUPF1的免疫纯化和蛋白质印迹分析。通过使用抗-hUPF1、抗-hSMG5、抗-hSMG6或抗-hSMG7兔抗体(Ohnishi等人，2003)的1/250稀释液、抗-hUPF3/3X兔抗体(Ishigaki等人，2001)或抗-TUBILIN小鼠抗体(SIGMA-ALDRICH)的1/1000稀释液进行蛋白质印迹分析。通过使用“SuperSignal West Pico ChemiluminescentSubstrate”或“SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate”(PIERCE)检测蛋白质。 [0134] II-结果 \n[0135] II-1新型NMD抑制剂的鉴定\n[0136] 用两种测试质体转染HeLa细胞，所述测试质体编码β-珠蛋白(G1)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)的RNA，并具有或提前(Ter)或不提前(Norm)的终止密码子。G1mRNA用于与非-红系细胞中的核相关的NMD(Thermann等人，1998；Zhang等人，1998)，而GPx1mRNA用于细胞质NMD(Moriarty等人，1998)。此外，也将编码严重尿蛋白(MUP)的mRNA的参比质体引入细胞(Ishigaki等人，2001)。 \n[0137] 转染后24小时，用DMSO(-)作为对照或用5μM表I中所示的吲哚化合物培养细胞20小时。20小时后，最终纯化总的RNA和用RT-PCR分析。 \n[0138] 不同测试的化合物的结果总结于表II。 \n[0139] 表II \n[0140] \n 化合物 Ter G1mRNA的稳定 Ter GPx1mRNA的稳定\n 13 - -\n 15 - -\n 17 - -\n 29 - -\n 35 - -\n 37 - -\n 39 - -\n 70 +++ ++\n 71 +++ ++\n 72 +++ ++\n 81 - -\n 497 +++ ++\n 500 +++ ++\n[0141] 结果表明在30种测试的化合物中，其中5种既可以稳定Ter G1mRNA水平又可以稳定Ter GPx1 mRNA水平，并且其是以剂量依赖的方式。该结果可通过RPA方法进一步确认。这些结果提供下述结论：化合物70、71、72、497和500是NMD的抑制剂，其既在细胞核又在细胞质。应当注意到，对这些化合物观察到的抑制水平与用其他NMD抑制剂观察到的类似，所述其他NMD抑制剂如环己酰亚胺或用编码hDCP2或hPARN的基因表达的siRNA灭活(Ishigaki等人，2001；Lejeune等人，2003)，这些化合物在实验条件下并不表现出任何细胞毒性(测试的最高浓度125μM)。 \n[0142] 在该水平，在不同体系(不抑制内含子的拼接，不抑制转化，和不形成应力颗粒(stress granule)中测试鉴别化合物的特性，该特性能表明这些化合物是新型特定NMD抑制剂。 \n[0143] II-2在hUPF1上游抑制NMD：\n[0144] 为了鉴别已识别的化合物的抑制模式，在mRNA上模拟NMD因子序列募集(sequential recruitment)的体系上测试所述化合物(Kim等人，2005；Lykke-Andersen等人，2000)。为了这样做，用两种类型的构建体转染细胞，其中一种构建体编码萤火虫荧光素酶(Fluc)的mRNA，在其3’UTR包含8个MS2蛋白质的结合部位的mRNA；第二种为编码MS2蛋白质或下列融合蛋白之一：MS2-hUPF1、MS2-hTPF2或 MS2-hUPF3X。此外，也用编码Renilla荧光素酶(Pluc)的mRNa的构建体转染HeLa细胞以归一化分析的RNA水平。 [0145] 然后用化合物70，或用DMSO(-)作为阴性对照培养细胞20小时。然后如前所述测定Rluc和Fluc mRNA的水平(Hosoda等人，2005)。作为对照，每种MS2融合蛋白的表达通过蛋白质印迹测定。 \n[0146] 结果表明在每种情况下，化合物70不影响MS2融合蛋白的表达水平，该水平从未高于内源蛋白质的表达水平。如同所预料到的和在DMSO存在下，与仅表达MS2的细胞相比，Fluc mRNA的表达水平在表达MS2-hUPF融合蛋白之一的细胞中较低。另一方面，结果表明化合物70干扰MS2-hUPF2或MS2-hUPF3X诱导的降解，但对MS2-hUPF1诱导的降解无影响。\n应当注意，Fluc/Rluc mRNA的比例和化合物70诱导的抑制水平与对应编码hCBP80的基因表达的siRNA灭活中观察到的那些(Hosoda等人，2005)非常类似。 \n[0147] 最后，结果表明化合物70的NMD抑制在hUPF3X或hUPF2的募集的下游，和在hUPF1功能的上游。 \n[0148] II-3化合物70不阻止hUPF1和hUPF3X之间的相互作用：\n[0149] 从前面的结果看，应想到化合物70能够通过与其他hUPF蛋白质的相互作用，阻止hUPF1至EJC的募集。为了这个目的，在保持mRNP整体性的条件下从HeLa细胞提取物免疫沉淀hUPF1蛋白质(Lejeune和Maquat，2004)。 \n[0150] 在免疫沉淀(IP)前，将DMSO(-)的化合物70加入细胞培养物20小时。目前表现出，hPF2蛋白质在NMD的某些情况下不是必要的(Geh环等人，2005)，分析聚焦于在每种免疫沉淀中存在的hUPF3X蛋白质。作为特性对照，在每种免疫沉淀中显示了微管蛋白缺失，并用其中未检测到蛋白质的常规兔血清进行了非-特定免疫沉淀。 \n[0151] 结果表明，即使当预先用化合物70培养过细胞时，hUPF3X蛋白质在hUPF1免疫沉淀中仍存在。 \n[0152] 因此，化合物70并未消除hUPF1和hUPF3X之间的相互作用，这一点表明该化合物并不抑制hUPF1至EJC的募集。 \n[0153] II-4化合物70稳定超磷酸化形式的hUPF1：\n[0154] 目前，NMD过程中hUPF 1要求磷酸化和脱磷酸化循环(Ohnishi等人，2003)，在化合物70存在下测试磷酸化的水平。为了这个目的，通过2D凝胶分析在化合物70或DMSO(-)培养的细胞内测试hUPF1的磷酸化水平。目前，血清影响hUPF1的磷酸化(Pal等人，2001)，使用293T细胞代替HeLa细胞，因为它们具有在血清缺失的情况下在细胞循环的同一步骤阻止其细胞分裂的能力。用表达载体pCI-neo-FLAG-hUpf1(Sun等人，1998)转染细胞，转染\n24小时后，通过血清缺失12小时同步细胞。最后，加入DMSO或5μM化合物70持续3小时，之后加入血清持续1小时。 \n[0155] 结果表明，不加入血清的情况下，FLAG-hUPF1蛋白质迁移和仅形成对应于非-磷酸化的蛋白质的单个点(Pal等人，2001)。加入血清后，当用DMSO培养细胞时，观察到FLAG-hUPF1蛋白质的中等磷酸化，当用化合物70培养细胞时，观察到FLAG-hUPF1的其他磷酸化的亚型稳定。 \n[0156] 因此，使用化合物70则可能稳定hUPF1蛋白质的超磷酸化亚型。 \n[0157] 目前认为，当将其超磷酸化时，蛋白质hUPF1位于P-小体(Unterholzner和Izaurralde，2004)，在化合物70存在和缺失的情况下测试FLAG-hUPF 1蛋白质在HeLa细胞中的细胞定位(localization)。 \n[0158] 结果表明，当用DMSO培养细胞时，外源的hUPF1蛋白质均匀分布在细胞质中，之前对非-处理的细胞(Mendell等人，2002)已经表明这一点，除了在hSMG7蛋白质共表达的实验中(其诱导hUPF1蛋白质在P-小体的募集(Unterholzner和Izaurralde，2004))。另一方面，当用化合物70预处理细胞时，在结构中观察到FLAG-hUPF1的细胞质富集，其共定位(co-localize)GFP-GE1、UFP-hSMG7、或CFP-hDCP1a，为P-小体的常用标记物。 [0159] 因此，化合物70或通过刺激磷酸化或通过抑制脱磷酸化诱导hUPF 1的超磷酸化亚型在P-小体聚积。 \n[0160] 为了确定已鉴别的化合物诱导两种机理之中的何种机理，进行hUPF1蛋白质从HeLa细胞免疫沉淀的补充分析，或用化合物70培养或不存在化合物70。 \n[0161] 在第一阶段，用其脱磷酸化复合物进行hUPF1的分析。结果表明可在用DMSO处理的细胞中检测到hSMG5、hSMG6和hSMG7，但另一方面，当预先用化合物70培养HeLa细胞时不可检测到hSMG5。 \n[0162] 因此，结果表明化合物70使得hUPF1和hSMG5之间的相互作用失稳。最后，在用或不用化合物70培养的细胞上进行的免疫沉淀中，hSMG1和hUPF3X的存在强烈表明已鉴别的化合物对hUPF1与其磷酸化复合物之间的相互作用无影响(图3A)。所得结果维护了下述事实：观察到的hUPF1超磷酸化态涉及缺乏脱磷酸化，尤其是缺乏hUPF1和hSMG5之间的相互作用，而不是涉及磷酸化的激活。最后，该结论与确认hSMG5是hUPF1脱磷酸化的必要组分相符(Ohnishi等人，2003)。 \n[0163] II-5在化合物70存在下从P-小体除去hSMG5：\n[0164] 公知hSMG5和hSMG7位于细胞质中，更特定地位于P-小体(Unterholzner和Izaurralde，2004)。 \n[0165] 用编码YFP-hSMG5、YFP-hSMG6或YFP-hSMG7((Unterholzner和Izaurralde，2004)的表达载体转染HeLa细胞，并用CFP-hDCP1a作为P-小体的标记物。24小时后，在DMSO或\n5μM化合物70存在下培养细胞。 \n[0166] 如之前所表明的，在缺乏抑制剂的情况下，YFP-hSMG5、YFP-hSMG6和YFP-hSMG7富集在细胞质集合体中(Fukuhara等人，2005；Unterholzner和Izaurralde，2004)，当使用CFP-DCP1a作为P-小体的标记物时，鉴定该集合体大部分在P-小体中。 \n[0167] 在化合物70存在下，包含YFP-hSMG6或YFP-hSMG7的细胞质集合体用P-小体的标记物CFP-DCP1a共定位。另一方面，在细胞质集合体中不再观察到hSMG5，但在化合物70处理的细胞中具有广泛的细胞质分布。 \n[0168] 目前表明化合物70抑制NMD和诱导hUPF1在P-小体中的富集，如用外源的或内源hUPF1蛋白质显示的，测试三种内源蛋白质hSMG在细胞质集合体的定位。该定位未曾被观察到，因为这些蛋白质太低的表达。通过用化合物70处理细胞，使得这些因子在P-小体内的稳定是可以理解的。 \n[0169] 结果表明，对于用DMSO处理的细胞，在细胞质集合体未检测到内源蛋白质。另一方面，当用化合物70培养细胞时，结果表明hSMG6和hSMG7蛋白质在P-小体富集，而在细胞质集合体未曾检测到hSMG5，证实了用外源的蛋白质得到的结果。 \n[0170] 最后，结果表明化合物70通过将其排除出P-小体改变了hSMG5的细胞定位。这种观察与当用化合物70培养细胞时，UPF1和SMG5之间失去相互作用一致。 \n[0171] II-6当用化合物70阻止NMD时，hUPF3和hUPF3X定位在P-小体\n[0172] 因为 某 些NMD的因 子，如hUPF1、hSMG5、hSMG6或hSMG7定 位 在P-小 体(Unterholzner和Izaurralde，2004)，认为其他NMD因子至少瞬时可进入P-小体。因为化合物70在hUPF1被限定在P-小体的步骤中阻止NMD，测试在处理和非-处理的细胞中的hUPF3和hUPF3X的细胞定位。表明两种蛋白质均主要为在非-处理的细胞中的核蛋白质(Serin等人，2001)。 \n[0173] 用编码hUPF3-FLAG或hUPF3X-FLAG的表达载体和下列P-小体标记物中的一种转染HeLa细胞：YFP-hSMG6、YFP-hSMG7、GFP-GE1和CFP-hDCP1a。在进行免疫荧光法实验之前，用DMSO或化合物70处理细胞。至于非-处理的细胞(Serin等人，2001)，当用DMSO(-)培养细胞时，hUPF3或hUPF3X基本定位在细胞核。另一方面，在在化合物70存在下培养细胞后，结果表明hUPF3和hUPF3X的细胞质定位在对应于P-小体的集合体内聚积。 [0174] II-7在化合物70存在下，包含PTC的mRNA聚集在P-小体： \n[0175] 目前，在化合物70存在下NMD因子聚集在P-小体，研究了NMD基质的定位。在酵母中，最近实际表明当NMD因子聚集在P-小体中时，当NMD被阻止，包含PTC的mRNA也聚集在P-小体中(Sheth和Parker，2006)。 \n[0176] 用Terp mCMV-G1或Terp mCMV-GPx1载体转染HeLa细胞，用下列P-小体的标记物分析所得mRNA的定位：GFP-GE1、YFP-hSMG6、 YFP-hSMG7、CFP-hDCP1、GFP-hCCR4、FLAG-hUPF1、hUPF3-FLAG和hUPF3X-FLAG。 \n[0177] 结果表明不存在抑制剂的情况下，不能检测到包含PTC的mRNA，或许是因为他们通过NMD快速降解。另一方面，用化合物70处理后，使得包含PTC的mRNA稳定和基本在与每个测试过的hUPF融合蛋白共定位的细胞质聚集体被检测。 \n[0178] 最后，结果表明包含PTC的mRNA存在于P-小体中或当用化合物70抑制NMD时，与后者相邻。 \n[0179] 也通过更有效的方法确认了当在哺乳动物细胞中阻止NMD时，包含PTC的mRNA在P-小体的聚积。在后者中，用24个SM2重复标记mRNA，这使得可以通过原位杂交检测独特的mRNA分子(Fusco等人，2003)。 \n[0180] 结果表明在参比细胞中，基本在细胞核检测到包含PTC的mRNA，被检测的细胞质分子不在P-小体聚集。当用化合物70抑制NMD时，结果表明包含PTC的mRNA在细胞质水平聚积，更特定地，在与P-小体共定位的结构中聚积。 \n[0181] 因此，这些结果确认了当其降解被抑制时，针对NMD的mRNA在P-小体聚集，该结果看起来并不是细胞-特有的。 \n[0182] 最后，结果表明用化合物70培养后，在P-小体中没有检测到野生型mRNA，其确认了已鉴别化合物的特定NMD-抑制功能，而不是抑制mRNA降解的普通功能。 \n[0183] II-8具有提前终止密码子的抗肌萎缩蛋白的mRNA稳定：\n[0184] 抗肌萎缩蛋白的基因由79个外显子组成，包括编码部分蛋白质、对该蛋白质在肌肉中的功能不重要的外显子70-79。 \n[0185] 在染上杜兴氏肌营养不良症(DMD)的患者中，存在在外显子70-79之一带有无义突变的患者。然而，因为通过NMD的mRNA降解，尽管该截短蛋白是有功能的，这些患者并不表达该抗肌萎缩蛋白。因此，在这些患者体内的NMD抑制将允许合成该截短但有功能的蛋白质。 \n[0186] 使用源自分别用DMD感染的患者的两个细胞系，因为内含子70的保留提供终止密码子，外显子75-76的删除引起读框移位并从而引起 在该mRNA上激活NMD的早期终止密码子的出现。 \n[0187] 将这两个细胞系用化合物70、71或72，或在DMSO存在下处理48小时。然后提取RNA并在定量条件下进行RT-PCR。 \n[0188] 结果表明大约通过因子4，接着用化合物70、71或72处理之后，抗肌萎缩蛋白mRNA稳定。 \n[0189] II-9在体内的NMD抑制：\n[0190] 对NMD机理使用两种小鼠模型(murine model)来研究化合物70在体内的作用。\n第一模型称为mdx小鼠。这些小鼠在抗肌萎缩蛋白基因的外显子23带有无义突变。这种无义密码子通过NMD诱导抗肌萎缩蛋白mRNA降解。这些小鼠在肌肉内接受DMSO(50μL)、\n20,200或2,000nmol的化合物70注射。6、24和32小时后，处死小鼠，对注射过的肌肉取样以从其提取RNA和蛋白质。初步结果显示抗肌萎缩蛋白mRNA在用化合物70注射的小鼠中稳定，在用DMSO注射的小鼠中不稳定。进一步地，截短的抗肌萎缩蛋白蛋白质本身也在用化合物70注射的小鼠体内检出，而在接受DMSO注射的小鼠体内未检出。 \n[0191] 使用的第二小鼠模型通过在鸦片受体的基因μ的外显子3上存在无义突变(MOR)定义。该终止密码子激活该MOR mRNA上的NMD。MOR基因仅在中枢神经系统中表达，这使得该模型成为研究化学化合物通过血脑屏障的可能性的非常有趣的工具。遵从与对mdx小鼠同样的程序，区别仅在于注射在小鼠的颈部在皮下进行，和在实验的不同阶段对脑部取样。\n在此处再一次地，第一结果显示MOR mRNA在用化合物70注射的小鼠中稳定，在仅用DMSO注射的小鼠中不稳定。MOR蛋白质的蛋白质印迹分析表明在同一用化合物70注射的小鼠中存在截短蛋白，在仅接受DMSO注射的小鼠中不存在。这些结果表明化合物70在体内活跃，并且其可能穿过血脑屏障，这使得该化合物为影响中枢神经系统和涉及NMD的病症的潜在治疗剂。 \n[0192] III-讨论 \n[0193] 通过本研究，可显示吲哚衍生物的NMD抑制能力。这些化合物通过阻止hUPF1和hSMG5之间的相互作用而发挥效力，其结果是将 hSMG5逐出P-小体，以及hUPF1的超磷酸化形式的稳定。 \n[0194] 最后，根据这些结果，可显示这些吲哚衍生物能够在体内抑制NMD和通过血脑屏障，这使得它们成为治疗许多与NMD有关的病变的良好候选。 \n[0195] 进一步地，证明这些化合物是通过之前从未可能的一种方法研究NMD机理的优异工具，之前从未可能是因为缺乏特定抑制该过程的工具。从而，实验室研究该NMD机理的好处是很可以想象到的。 \n[0196] 参考文献： \n[0197] Balkan，F.；Elmes，B.C.；Loder，J.W.Australian Journal of Chemistry1969，\n22，2489. \n[0198] Bashkirov，V.I.，H.Scherthan，J.A.Solinger，J.M.Buerstedde，and W.D.Heyer.1997.A mouse cytoplasmic exoribonuclease(mXRN 1p)withpreference for G4 tetraplex substrates.J Cell Biol.136：761-73. \n[0199] Belgrader，P.，and L.E.Maquat.1994.Nonsense but not missense mutationscan decrease the abundance of nuclear mRNA for the mouse major urinaryprotein，while both types of mutations can facilitate exon skiPPing.MolCell Biol.14：6326-36. \n[0200] 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